受体酪氨酸激酶Mer对高糖环境培养的大鼠雪旺细胞系RSC96增殖调控作用观察

目的观察受体酪氨酸激酶Mer(MER tyrosine kinase,Mertk)在高糖环境培养条件下的大鼠雪旺细胞系RSC96增殖的调控作用。方法取RSC96分为一、二、三、四、五组,分别置于含25(正常葡萄糖浓度)、50、75、100及125 mmol/L葡萄糖的培养基中培养,培养48 h时采用Western Blotting法检测各组细胞Mertk,筛选Mertk蛋白相对表达量最高浓度为后续研究的高糖浓度。取RSC96细胞先饥饿处理4 h,置入含100 mmol/L的葡萄糖培养基中,分别于培养0、24、36、48、60 h时取各组细胞,采用Western Blotting法检测各组细胞Mertk,最终筛选Mertk蛋白相对表达量高的时间为后续研究培养时间。取RSC96细胞,分为对照组、高糖组、高糖敲降组及敲降组:高糖组细胞饥饿处理4 h,置于含100 mmol/L葡萄糖的培养基中培养;高糖敲降组细胞饥饿处理4 h,置于含100 mmol/L葡萄糖的培养基中,后加入5μL的敲降Mertk基因表达siRNA溶液;敲降组细胞饥饿处理4 h,加入5μL的敲降Mertk基因表达siRNA溶液;对照组细胞用正常培养基培养。培养48 h时取各组细胞,采用Edu法测算各组细胞增殖活力,采用Western Blotting法检测各组细胞Mertk、磷酸化核转录因子κB、P65及肿瘤坏死因子α(TNF-α)。结果与一组相比,四、五组细胞Mertk蛋白相对表达量高(P均<0.05);与培养0 h相比,培养48、60 h时RSC96细胞Mertk相对表达量高(P均<0.05)。与对照组相比,高糖组细胞增殖活力低(P<0.05),敲降组细胞增殖活力高(P<0.05);与对照组相比,高糖敲降组细胞P65、TNF-α相对表达量高(P均<0.05),敲降组细胞Mertk相对表达量低、P65及TNF-α相对表达量高(P均<0.05),高糖组细胞Mertk、P65及TNF-α相对表达量高(P均<0.05)。结论敲降Mertk基因表达的高糖环境培养RSC96细胞的增殖能力高,细胞P65、TNF-α表达高。Mertk可能通过促进细胞P65、TNF-α表达,促进高糖环境培养RSC96细胞的增殖。

Mer受体酪氨酸激酶与SD大鼠糖尿病周围神经病变的相关性

背景:糖尿病周围神经病变的发病机制目前尚未明确,TAM(Tyro3、Axl和MerTK)受体酪氨酸激酶具有控制中枢神经系统凋亡细胞和抑制炎症反应的作用。目的:探讨2型糖尿病及其周围神经病变SD大鼠血浆及坐骨神经组织Mer受体酪氨酸激酶水平的差异,研究Mer受体酪氨酸激酶与糖尿病周围神经病变的关联性。方法:40只雄性SD大鼠随机分为对照组15只、2型糖尿病组10只及2型糖尿病周围神经病变组15只。对照组大鼠喂普通饲料,实验组大鼠行高脂高糖饮食6周,并腹腔内注射单剂量小剂量链脲佐菌素35 mg/kg,14 d尾静脉取血检测血糖≥16.7 mmol/L为2型糖尿病造模成功。周围神经病变组大鼠动物继续高糖、高脂喂养8周。麻醉后活体分离检测大鼠坐骨神经传导速度,腹主动脉取血,取坐骨神经组织。光镜下观察各组神经纤维组织学改变,确认糖尿病周围神经病变造模成功。ELISA检测大鼠外周血血糖、血脂及血清MerTK水平,苏木精-伊红染色观察坐骨神经组织学改变;免疫荧光、免疫组化及免疫蛋白印迹检测坐骨神经组织中MerTK的表达。结果与结论:①实验成功构建SD大鼠2型糖尿病及2型糖尿病周围神经病变大鼠模型,糖尿病周围神经病变成模率80%;与对照组比较,2型糖尿病及糖尿病周围神经病变组大鼠血糖水平显著升高(P<0.0001),糖尿病周围神经病变组高于2型糖尿病组;坐骨神经传导速度明显下降(P<0.05),糖尿病周围神经病变组低于2型糖尿病组。②组织学检查:与对照组相比,2型糖尿病组大鼠坐骨神经核减少,有部分空泡变性,出现吞噬细胞;糖尿病周围神经病变组胞体肿胀,核间距增大,出现空泡变性,髓鞘周围出现隔断、不平滑,轴索变为网格状。③血清中MerTK水平:糖尿病周围神经病变组显著高于对照组(P<0.05)。④坐骨神经组织中MerTK的表达:与对照组比较,糖尿病周围神经病变组中明显上调(P<0.05)。⑤结论:糖尿病周围神经病变大鼠血浆及坐骨神经组织中Mer受体酪氨酸激酶水平升高,推测与其抗炎及免疫调节作用有关。

小分子Mer激酶抑制剂研究进展

Mer(monocytesepithelial tissue reproductive tissue)激酶参与调节细胞分化、存活、迁移及炎症细胞因子的释放等复杂生理进程,其过度表达可导致肿瘤的发生、增殖和侵袭等,因此抑制Mer激酶活性已成为肿瘤治疗的新策略。本文对Mer激酶的结构、生物学功能以及相关的小分子抑制剂的研究进展进行综述,并结合作者自身研发经历进行展望。

新型Mer酪氨酸激酶抑制剂核心骨架的虚拟筛选

目的发现一系列新型选择性Mer酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的母核结构,并依据其设计化合物。方法分别利用3个已发表的Mer TK及配体(化合物1、2和3)的复合晶体结构(PDB code:3TCP,4MHA和4M3Q),由ZINCPharmer来产生只包含配体核心区域的药效团模型,并对ZINC化合物库进行筛选。筛选结果经过分析、归类,得到新型母核结构,据其设计化合物,并利用分子对接技术对设计化合物进行初步评价。结果药效团筛选得到含有16 253个化合物的数据集,归类为12种核心结构,它们可以和关键氨基酸形成相互作用的原子或基团。其中,化合物12将疏水脂肪链含于芳环中,结构变化较大,依据其设计了化合物16a^16d,分子对接发现16c评分最高,可作为进一步理性设计的基础。结论本研究通过基于药效团模型的虚拟筛选方法,发现了一系列选择性Mer TKI母核结构的替代物,它们保持了选择性抑制剂与靶点的关键作用,可应用于新化合物的设计中。同时,此方法也可用于其他靶标药物的发现中。

2-芳基-4-(反式-4-羟基环己胺基)-5-乙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物的设计合成及其Mer酪氨酸激酶抑制活性研究

目的设计和合成系列2-芳基-4-(反式-4-羟基环己胺基)-5-乙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物,并测试其Mer酪氨酸激酶(MerTK)抑制活性和肿瘤细胞增殖抑制活性。方法以2,4-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1)为起始原料,经碘代、对甲苯磺酰基(Ts)保护、亲核取代、Stille偶联、双键还原、Suzuki偶联和脱Ts保护共7步反应制得目标化合物。采用Kinase-Glo发光法来检测化合物的MerTK抑制活性。采用CCK8或SRB法,检测化合物对MV-4-11和A549、MDA-MB-231、KB、KB-vin肿瘤细胞的增殖抑制活性。使用软件DS3.0对MerTK和化合物6h进行分子对接研究。结果合成目标化合物9个,结构均经1H NMR和MS确证。化合物6h显示出一定的MerTK抑制活性,IC50值为(6.7±0.3)μmol/L。该化合物对MV-4-11细胞增殖也显示出一定的选择性抑制活性,GI50值为(6.6±1.1)μmol/L,其对MV-4-11细胞的抑制作用比对其他所试细胞的抑制作用强约3~6倍。分子对接显示,6h作用于MerTk的UNC569结合位点与之结合,但结合能较UNC569高。结论化合物6h对MV-4-11肿瘤细胞显示出了一定的选择性抑制活性,该选择性活性是否与其对MerTK的抑制作用有关系,还需通过进一步生物学实验来阐明。分子对接结果提示,对7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶母核的2位和5位进行进一步结构修饰,有可能会提高对MerTK的抑制活性。

Mer受体酪氨酸激酶蛋白在胃癌组织中的表达及意义

目的探讨Mer受体酪氨酸激酶(MerTK)蛋白在胃癌组织中的表达及意义。方法选取2014年1月至2017年4月在我院诊治的胃癌患者121例为研究对象,术中共获得121例胃癌组织和67例癌旁组织标本。采用免疫组化法检测胃组织中MerTK蛋白的表达,分析胃癌组织中MerTK蛋白高表达的影响因素,探讨MerTK蛋白与胃癌患者预后的关系。结果①121例胃癌组织中MerTK蛋白高表达49例,占40.5%,低表达72例,占59.5%,MerTK蛋白主要表达于细胞质,其在癌旁正常胃组织中均低表达(100.0%)。②单因素分析显示,MerTK蛋白表达与胃癌患者年龄、肿瘤大小、肿瘤Lauren分型、远处转移和TNM分期有关(P<0.05)。多因素分析结果显示,年龄(>60岁)、肿瘤Lauren分型(弥漫型)、远处转移和TNM分期(Ⅲ期)是MerTK蛋白高表达的独立影响因素(P<0.05)。③所有患者均随访至2018年4月,随访时间为9～39个月,中位随访时间为36.5个月。随访期间有11例死亡,均因肿瘤复发。④单因素分析发现,胃癌患者的预后和MerTK蛋白表达强度和MerTK蛋白染色积分有关(P<0.05)。多因素分析发现,MerTK蛋白的表达强度是胃癌患者死亡的独立危险因素(P<0.05)。MerTK蛋白低表达患者的2年生存率为58.5%,明显高于高表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论年龄(>60岁)、肿瘤Lauren分型(弥漫型)、远处转移和TNM分期(Ⅲ期)是MerTK蛋白高表达的独立影响因素。胃癌组织MerTK蛋白的高表达与患者预后有关。

可溶性Mer受体酪氨酸激酶在系统性红斑狼疮中的临床意义

目的研究可溶性Mer受体酪氨酸激酶在系统性红斑狼疮中的临床意义。方法系统性红斑狼疮患者114例为观察组,同期于我院健康体检中心进行体检的114例健康人为疾病对照组,测定其血清s Mer受体酪氨酸激酶水平,并分析其水平高低与系统性红斑狼疮各种临床症状、实验室检查指标、疾病活动度之间的关系。结果观察组患者血清s Mer受体酪氨酸激酶水平(10.64±5.98)ng/m L,明显高于健康对照组的(2.71±2.19)ng/m L。观察组血清s Mer受体酪氨酸激酶水平与Anu A、ds DNA抗体、ACL水平呈正相关。伴狼疮性肾炎的系统性红斑狼疮患者血清s Mer受体酪氨酸激酶水平为(11.22±6.14)ng/m L,明显高于不伴狼疮性肾炎患者的(8.96±5.92)ng/m L。血清s Mer受体酪氨酸激酶水平与伴狼疮性肾炎患者的血肌酐水平、24h尿蛋白定量呈正相关,而与e-GFR呈负相关。结论系统性红斑狼疮患者血清s Mer受体酪氨酸激酶水平明显升高,可能与发生狼疮性肾炎、血液系统损害有关,并可预测系统性红斑狼疮疾病活动度。

穴位埋线对心肌梗死大鼠巨噬细胞MerTK胞葬作用的影响

目的观察“内关”和“心俞”穴位埋线对心肌梗死大鼠巨噬细胞Mer受体酪氨酸激酶(MerTK)相关表达影响,探讨“内关”和“心俞”穴位埋线对心肌梗死大鼠心肌肥大其可能的机制作用。方法雄性大鼠(SD)采用左冠状动脉前降结扎法构建心肌梗死模型,按照随机数字法分为伪手术组、模型组、“内关”和“心俞”穴位埋线组、培哚普利组,每组5只,其中伪手术组只开胸撕开心包膜。术后第2天开始干预治疗,以第7、28天为观测点。苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织病理形态,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-6、TNF-α、IL-1β浓度水平,蛋白质印迹(Western blotting)检测心肌组织MerTK、p-Mertk蛋白表达。结果(1)与伪手术组大鼠相比较,模型建构后7、28 d,模型组大鼠HE染色心肌细胞形态异常、错乱排列,游离细胞核增多,见明显的细胞间质且心肌细胞横截面积增大(P<0.05),血清IL-6、TNF-α、IL-1β浓度呈明显上升趋势,MerTK蛋白表达降低(P<0.05),p-MerTK蛋白表达升高(P<0.05)。(2)与模型组大鼠相比较,治疗后7、28 d,两治疗组大鼠HE染色心肌细胞形态和大小相对规则,排列相较平行有序,心肌细胞核游离及肥大的情况均有不同程度改善且心肌细胞横截面积均不同程度降低(P<0.05),IL-6、TNF-α、IL-1β浓度均下降(P<0.05),MerTK蛋白表达均不同程度升高(P<0.05),p-MerTK蛋白表达不同程度降低。结论“内关”和“心俞”埋线能够改善心肌梗死大鼠心肌肥大的程度,其机制可能与维持心肌组织中巨噬细胞表面受体MerTK的表达、降低血清炎症细胞因子含量相关。

可溶性Mer受体酪氨酸激酶在系统性红斑狼疮中的临床意义

目的 探讨可溶性Mer受体酪氨酸激酶（sMerTK）在SLE患者血清检测中的临床意义.方法 采用ELISA法分别检测101例SLE与96例疾病对照组患者,及62名健康对照组血清中sMerTK水平;分析比较其与SLE各种临床表现、实验室指标及疾病活动度的关系.采用t检验χ^2检验及Spearman相关分析法进行数据分析.结果 SLE患者血清中sMerTK水平[（10.6±6.0）ng/ml]明显高于疾病对照组[（4.4±2.0） ng/ml]（t=9.704,P＜0.01）及健康对照组[（2.8±2.5）ng/ml] （t=1 1.505,P＜0.01）.血清sMerTK浓度与SLE患者的性别、年龄、病程无关,与白细胞（r=-0.236,P=0.017）、血红蛋白（r=-0.354,P＜0.01）、血小板（r=-0.310,P=0.002）水平呈负相关.在伴有LN患者中,血清sMerTK水平[（11±6） ng/ml]高于不伴有LN的SLE患者[（9±6）ng/ml],差异具有统计学意义（t=2.071,P=0.041）.sMerTK水平的高低与LN患者尿蛋白定量（24 h）（r=0.293,P=0.013）、血清肌酐（r=0.250,P=0.035）及肾小球滤过率（r=-0.201,P=0.045）的水平有相关性,与血清补体C3 （r=-0.447,P＜0.01）及补体C4（r=-0.357,P＜0.01）水平呈负相关,与抗dsDNA抗体（r=0.360,P＜0.01）、抗核小体抗体（AnuA） （r=0.264,P=0.016）及SLEDAI积分（r=0.473,P＜0.01）呈正相关.结论 SLE患者血清sMerTK水平明显升高,可能与患者的血液系统损害及LN相关,并提示狼疮病情活动.

转谷氨酰胺酶2和Mer受体酪氨酸激酶基因共沉默在小鼠动脉粥样硬化斑块失稳中的作用

目的观察受体转谷氨酰胺酶（TG2）和Mer受体酪氨酸激酶（Mertk）共沉默的腺病毒干扰载体在小鼠动脉粥样硬化（As）斑块失稳中的作用。方法建立小鼠As模型，随机分为pAdTrack/TG2/Mertk组（n=10）、pAdTrack/TG2组（n=10）以及pAdTrack／Mertk组（n=10），于一侧髂总动脉斑块局部分别转染上述腺病毒干扰载体，另一侧髂总动脉转染pAdTraek/绿色荧光蛋白（GFP）作为对照组。转染8周后，采用Westernblot法检测各组斑块内TG2和Mertk蛋白表达，采用显微超声检测斑块的偏心指数和重构指数，并计算易损指数，采用免疫组织化学法检测斑块的脂质、胶原、巨噬细胞和平滑肌细胞含量。结果pAdTrack/TG2/Mertk组和pAdTrack/TG2组的TG2蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05），但两组均显著低于pAdTrack/Mertk组和pAdTrack/GFP组的TG2蛋白表达（P〈0．01），pAdTrack/TG2/Mertk组和pAdTrack/Mertk组的Mertk蛋白表达比较差异无统计学意义（P〉0．05），但两组均显著低于pAdTrack/TG2组和pAdTrack/GFP组的Mertk蛋白表达（P〈0．01）；与其他3组比较，pAdTrack/TG2/Mertk组的偏心指数和重构指数显著增高（P〈0．05），pAdTrack/TG2/Mertk组易损指数显著增高（P〈0．01），pAdTrack/TG2/Mertk组脂质含量显著增高（P〈0．01），pAdTrack/TG2/Mertk组胶原含量显著降低（P〈0．05），pAdTrack/TG2/Mertk组巨噬细胞含量显著增高（P〈0．05），而每组的平滑肌数量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论TG2和Mertk共沉默的腺病毒干扰载体在小鼠AS斑块失稳中起着重要作用。

糖尿病视网膜病变中Gas6/MerTK/GPX4信号通路参与铁诱导的细胞死亡的作用研究

目的探讨糖尿病视网膜病变(DR)中配体生长停滞特异性蛋白6(Gas6)/Mer酪氨酸激酶(MerTK)信号通路参与铁诱导的细胞死亡的作用。方法人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)分为对照组、HG组、HG+sh-Gas6组和HG+Gas6组。将细胞暴露于25 mmol/L D-葡萄糖用于模拟体外高血糖(HG)环境。对照组暴露于20 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖环境。将大鼠随机分为正常对照组、DR组、DR+Gas6组,每组20只。通过腹膜内注射STZ溶液建立DR模型。通过细胞计数检测试剂盒-8(CCK-8)评估细胞增殖。通过流式细胞术测量脂质活性氧(ROS)水平,并通过生化测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平来评估铁死亡。通过Western blot法分析Gas6、MerTK蛋白表达情况。结果与HG组相比,HG+Gas6组细胞活力、SOD、GSH-Px水平显著增加(P<0.05),脂质-ROS、MDA水平显著降低(P<0.05);HG+sh-Gas6组细胞活力、SOD、GSH-Px水平显著降低(P<0.05),脂质-ROS、MDA水平显著增加(P<0.05)。此外,HG+Gas6组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达较HG组显著增加(P<0.05),HG+sh-Gas6组细胞中GPX4蛋白表达较HG组显著减少(P<0.05)。与对照组相比,DR组大鼠的平均视网膜神经纤维层厚度显著降低(P<0.05),DR+Gas6组则较DR组显著增加(P<0.05)。此外,DR+Gas6组视网膜色素上皮(RPE)组织中MDA、铁水平显著降低(P<0.05),GSH水平和Gas6、MerTK、GPX4蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论HG处理通过抑制Gas6/MerTK信号通路,加速GPX4的清除,诱导ARPE-19细胞的铁死亡和细胞生长抑制。此外,通过上调DR大鼠视网膜组织中Gas6/MerTK信号表达,减轻RPE组织中铁死亡和氧化应激,并有助于恢复视网膜平均视网膜神经纤维层厚度。

冠心康含药血清对RAW264.7巨噬细胞MerTK表达的影响

目的:通过观察冠心康含药血清对RAW264.7巨噬细胞Mer受体酪氨酸激酶(Mer tyrosine kinase,Mer TK)表达的影响,探讨冠心康抗动脉粥样硬化的可能作用机制。方法:SD大鼠给予冠心康灌胃,2次/d,连续给药5 d后制备冠心康含药血清。体外常规培养RAW264.7巨噬细胞,实验分为空白对照组(加10%浓度的正常血清)、模型组[加10%浓度的正常血清+20 mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)]、冠心康组(加10%浓度的冠心康含药血清+20 mg/L ox-LDL)。干预12 h后采用RT-q PCR检测各组巨噬细胞的Mer TK mRNA表达;干预24 h后采用Western blot法检测各组巨噬细胞的Mer TK蛋白表达。结果:与空白对照组比较,模型组Mer TK mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,冠心康组Mer TK mRNA和蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01)。结论:冠心康抗动脉粥样硬化的作用可能与上调巨噬细胞Mer TK的mRNA和蛋白表达有关。

TG2和Mertk基因共沉默腺病毒干扰载体的构建及其基因沉默作用

目的构建转谷氨酰胺酶2(TG2)和Mer受体酪氨酸激酶(Mertk)基因共沉默腺病毒干扰载体,并检测其基因沉默作用。方法首先构建能干扰TG2和Mertk蛋白表达的质粒载体pSUPER/TG2及pSUPER/Mertk,再将其干扰序列和H1启动子序列切下并连接到pAdTrack上,构建成pAdTrack/TG2/Mertk载体。将其转入含有pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,回收并酶切鉴定重组腺病毒载体。将阳性腺病毒载体感染HEK293细胞,收集病毒,反复扩增后测定病毒滴度。分别以pAdTrack/TG2/Mertk、pAdTrack/TG2、pAdTrack/Mertk及pAdTrack/绿色荧光蛋白(GFP)感染RAW264.7细胞,采用免疫印迹法检测其TG2蛋白和Mertk蛋白的表达水平。结果pAdTrack/TG2/Mertk载体的病毒滴度为6.13×1010GFU/mL。经酶切鉴定,pAdTrack/TG2/Mertk含有插入的2个启动子和2个干扰序列,载体构建成功。pAdTrack/TG2和pAdTrack/TG2/Mertk组TG2蛋白的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),但均低于pAdTrack/GFP和pAdTrack/Mertk组(P<0.01),后两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。pAdTrack/Mertk和pAdTrack/TG2/Mertk组Mertk蛋白的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),但均低于pAdTrack/GFP和pAdTrack/TG2组(P<0.01),后两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TG2和Mertk基因共沉默腺病毒干扰载体pAdTrack/TG2/Mertk构建成功,其能显著降低小鼠巨噬细胞样RAW246.7细胞中TG2蛋白和Mertk蛋白的表达水平。