不同盐度对文蛤(Meretrix meretrix)呼吸代谢及体内酶活性的影响

为研究不同盐度对文蛤呼吸代谢的影响,本实验设置5个盐度(‰)梯度(11、18、25、32、39),检测不同盐度对文蛤(Meretrixmeretrix)耗氧和排氨的影响,以及文蛤的外套膜、鳃、肝胰腺三种组织中乳酸脱氢酶和Na+/K+-ATP酶活性的变化。结果表明:随着盐度的不断升高,文蛤耗氧率先升后降再升,在盐度18时达到最大值;排氨率先升后降,在盐度32时达到最大值。随着盐度不断升高和胁迫时间延长,文蛤的肝胰腺中乳酸脱氢酶活力总体呈先升高后下降再升高的趋势(P<0.05),酶活力在盐度39时为最高;随着盐度不断升高和胁迫时间延长,文蛤的外套膜中Na+/K+-ATP酶活力总体呈先下降再升高后下降的趋势(P<0.05),在盐度32时为最高;文蛤的外套膜和鳃中乳酸脱氢酶活力以及鳃和肝胰腺中Na+/K+-ATP酶活力受盐度影响不显著(P>0.05),酶活力变化也多呈现"W"形的变化趋势。研究结果为文蛤的人工养殖提供参考。

文蛤(Meretrix meretrix)地理种群ISSR分子标记的初步研究

利用ISSR(InterSimpleSequenceRepeate)技术对文蛤(Meretrixmeretrix)江苏和辽宁两个地理种群进行了PCR扩增.从100条ISSR引物中筛选出引物13条,每条引物检测出位点数1到8.平均每条引物可检测到位点数4 6个.实验结果表明:江苏文蛤的位点多态性(80 7%)高于辽宁文蛤的位点多态性(68 4%);种群内平均遗传距离分别为0 3105±0 090和0 2658±0 044,江苏文蛤也高于辽宁文蛤.从筛选得到的引物可以发现,文蛤简单重复序列中A、G碱基含量较高.通过对不同实验条件的对比,对ISSR PCR反应体系进行了优化.

文蛤Meretrix meretrix化学成分研究

首次从文蛤中分离得到3个甾醇,通过MS,IR,NMR谱确定其结构为胆甾醇(1)、5α,8α^-过氧胆甾-6-烯-3β-醇(2)、和胆甾-4-烯-3β,6β-二醇(3)。

文蛤属(Meretrix)16S rRNA基因及ITS1序列的系统学分析

利用线粒体16SrRNA基因片段及核糖体DNA转录间隔区ITS1序列分析的方法,以近缘属的青蛤(Cyclinasinensis)为外群,对文蛤属的文蛤(M.meretrix)、丽文蛤(M.lusoria)、帘文蛤(M.lyrata)和斧文蛤(M.lamarckii)4种贝类进行了系统学研究。经ClustalX多重比对及DNAsp软件分析后,用PAUP4.0分析软件,计算出种间序列的碱基转换/颠换频率,利用邻接法NJ构建系统发育树。结果表明,帘文蛤与该属其他三种的分歧时间较早,两类序列与其他种类间的相对遗传距离分别在0.25866—0.28218和0.15644—0.20104之间。文蛤与丽文蛤间的16SrDNA及ITS1序列间的遗传距离仅为0.04805和0.04201,拓扑结构图显示关系很近,并且二者的分布区大面积重叠,其序列间的转换/颠换频率接近种内单元型(haplotype)间的序列变化,鉴于它们的贝壳形态有一定差别,应归为同一个种内的不同地理亚种比较恰当。

基于形态参数和AFLP标记的文蛤(Meretrix meretrix)不同地理群体遗传变异分析

应用方差分析和Tukey多重比较对文蛤的辽宁(LN)、山东(SD)、江苏(JS)、广西(GX)4个自然地理群体的7个壳形态参数进行了研究,结果发现,SD和JS群体间差异不显著,LN和GX群体差异不显著,GX群体与SD和JS群体间差异显著(P<0.05)。利用4对引物组合对这4个群体进行了AFLP扩增,共得到236个位点,其中特有位点14个,这些特有位点可作为群体鉴别的特征性标记。遗传多样性分析表明,4个文蛤群体的遗传多样性水平均较高,而以GX群体最高,Nei’s基因多样性指数和Shannon’s多样性指数分别达到0.2636、0.3961,SD群体最低,分别为0.2308、0.3462。从群体间遗传距离和NJ法构建的亲缘关系谱系图来看,LN和SD群体的遗传距离最近(0.0394),首先聚在一起,而GX群体与其他3个群体间都较远(0.1271—0.1586),单独分出一支,这说明GX群体已发生了明显的遗传分化,用它与其他3个群体杂交可望较大幅度地提高遗传多样性水平。

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的ITS2分析

采用分子生物学方法,进行了江苏和广西两个地区不同花纹文蛤群体的核糖体DNA转录间隔区(ITS2)的序列分析研究。结果表明,广西的文蛤群体和江苏的群体相比较,仅发现江苏群体在333—336bp处发生了缺失,江苏群体内不同花纹文蛤个体间的ITS2也发生了变化。聚类分析结果证实了序列分析结果,广西文蛤群体和江苏文蛤群体间发生了遗传变异,江苏文蛤群体内部也发生了遗传分化。

我国沿海不同地理原种文蛤(Meretrix meretrix)的SRAP分析

采用序列相关扩增多态SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)标记对国家级江苏文蛤良种场(筹)保存的广西北海(GX)、江苏南通(JS)、辽宁大连(LN)三个地理种群原种文蛤进行种质资源分析。结果表明:(1)15对引物在文蛤3种群共扩增223个位点,其中多态位点数为159个,多态性位点百分率为71.30%,显示了较高的多态性;(2)GX、JS、LN3种群的多态性位点百分率分别为69.12%、57.81%、51.85%,平均杂合度分别为0.2532、0.2162、0.1836,香农信息指数分别为0.3649、0.3127、0.2714,均以GX种群最高,表明GX种群遗传多样性更为丰富;(3)3种群扩增位点显性基因频率的分布规律揭示,与LN和JS两种群相比,GX种群中低频基因位点显著增加,而隐性纯合基因位点显著减少,表明GX种群中存在大量稀有等位基因。各地理种群原种文蛤遗传多样性水平相对较高,遗传改良潜力大,GX种群作为选择育种的基础群更为适合。

文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表达分析

C-型凝集素是一种重要的模式识别蛋白,本研究以文蛤为材料。利用PCR扩增和RACE技术首次获得了编码文蛤C-型凝集素的基因(Mm-CTL)c DNA序列,全长为1855bp,其开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。Smart软件预测Mm-CTL的糖识别结构域(CRD)从第34个氨基酸到第168个氨基酸。BLASTP序列相似性分析显示,Mm-CTL与大竹蛏氨基酸序列同源性最高,相似性为56.5%,与其它无脊椎动物的相似性为13.5%—23.9%。系统进化树分析与同源分析结果一致,其中Mm-CTL与双壳类C-型凝集素聚在一起,与大竹蛏亲缘性最近。环境胁迫实验显示,溶藻弧菌感染6h时Mm-CTL表达量明显上升,在12h时达到最高值,随后有所下降。盐度胁迫时Mm-CTL在盐度5时表达量相对较低,在盐度10—20中的表达量相对较高。温度胁迫时Mm-CTL在35°C时表达量相对最高,10°C时表达量明显较低。研究结果表明,文蛤应对环境因子影响可通过调节Mm-CTL的表达来应答免疫反应。本研究将为贝类先天性免疫因子研究以及病害的防控奠定基础。

文蛤(Meretrix meretrix)精子的超微结构及精子入卵过程的电镜观察

利用透射电镜和扫描电镜对文蛤精子的超微结构及精子入卵过程进行了详细观察。结果显示,文蛤精子为典型的原生型,由头部、中段和尾部三部分组成,全长45—50μm。头部呈狭茧形,长约3.0μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈倒"V"字形,前端有短柱状的凸起;细胞核为稍弯曲的圆柱形,内含高度浓缩的染色质,无核前窝,有核后窝。中段较短,仅0.6—0.7μm,由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个圆球形的线粒体呈单层梅花状排列,内部为双层膜折叠成的片层状结构;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,而远端中心粒延伸出尾鞭的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,长约42—45μm,内部的轴丝呈典型的"9+2"结构,外周有波浪状质膜包被。用扫描电镜观察了文蛤精子的入卵过程,大致将其分为顶体反应期、穿卵期和卵膜修复期。受精后2min,精子发生顶体反应,顶体泡破裂释放溶解酶使卵膜变得疏松,亚顶体腔中伸出的顶体丝先穿透卵膜;受精后4—6min,在精、卵的共同作用下,精子头部和中段逐渐穿过卵膜进入卵内,在卵膜上形成一个直径约1.5μm的孔道,而精子尾部则留于卵外;受精后8—10min,精子尾部脱落,受精形成的孔道被卵膜的微绒毛修复。另外对多种双壳贝类精子超微结构和线粒体入卵等问题进行了探讨。

文蛤(Meretrix meretrix)体内氨基脲含量与环境相关性研究

采用超高效液相色谱-串联质谱法进行了文蛤体内氨基脲含量与环境相关性研究。在(13±1)℃的水温条件下,将文蛤分别浸浴于氨基脲浓度1.0μg/L、5.0μg/L的海水中6天进行吸收试验,第7天起隔天换水进行消除试验,结果表明:文蛤对水体中氨基脲的富集能力较低,蓄积量随时间的延长和给药浓度的增加而增加。氨基脲在不同浓度中具有相似的消除规律:初始阶段均具有较高的消除速率,随后消除趋势趋于平缓,并在一段时间内维持一定质量分数;至试验结束时,低浓度组和高浓度组文蛤体内氨基脲最终降低至低于检出限(0.5μg/kg);本研究所得的药时曲线对贝类氨基脲污染的净化提供了数据支持。

广西文蛤(Meretrix)的fAFLP及ITS分析

利用fAFLP标记技术和PCR-RFLP技术,对采集于广西的形态和壳色变异很大的2个文蛤群体(G、W)以及山东文蛤(S)群体进行了遗传结构和亲缘关系研究。fAFLP分析显示:在457个总扩增位点中存在53个W群体的特异性位点(其中9个为100%显性)、21个G群体的特异性位点、14个S群体的特异性位点,这些位点可作为群体鉴别的特征性标记;通过计算群体间相对遗传距离和聚类分析,发现S和G间的遗传距离最小(0.0424),在系统树上首先聚在一起,而W与S、G的相对遗传距离均很大(0.2308和0.2305),单独分出一支。对文蛤核糖体ITS的PCR-RFLP结果显示:W的三个不同壳色类群(WX、WC、WH)的酶切结果完全一致,而与G和S群体差别较大;G和S群体基本一致,但也稍有差别。进一步的ITS序列分析显示:W的ITS序列长度为1266—1269bp,而G和S分别为1614bp和1520bp;W群体内部序列比较保守,而与G和S群体之间在ITS1和ITS2开始和结尾处均存在多处插入/缺失;在依据序列构建的系统树上,WX、WC、WH三个类群聚在一起,S和G聚为另一支,两支相距甚远。本研究结果表明,fAFLP标记分析、PCR-RFLP分析和ITS序列分析结果一致,W群体和G、S群体的差异较大,已超出种内群体间的遗传变异,S和G尽管存在遗传分化,但仍应同属Meretrix meretrix一个物种。

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的外套膜蛋白质的双向电泳研究

采用双向电泳技术,对浙江乐清无花纹和有花纹文蛤外套膜的全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析。经PDQuest软件分析,在pH4—7,分子量14.3—200kD之间,无花纹文蛤样品中检测到682±24个蛋白质点,有花纹样品检测到600±35个蛋白质点,平均匹配率为84.5%。研究结果显示,两种文蛤共有256个点存在差异表达,这些差异点可能与贝壳的颜色和花纹形成有关。其中98个点为无花纹文蛤特有,57个点为有花纹文蛤特有,另有101个点在表达量上存在两倍以上差异。在无花纹贝壳中发现分子量为42kD左右,等电点为6.4左右,与库蚊的肌动蛋白(分子量为41.7kD,等电点为5.3)匹配率较高;分子量为29kD,等电点为5.6,与飞鱿的肌动蛋白(分子量为29kD,等电点为5.25)匹配率较高的两个蛋白质。在有花纹文蛤中发现了分子量为27kD左右,等电点为4.8,与丽文蛤属的肌浆钙结合蛋白(分子量为20.8kD,等电点为4.98)匹配率较高。

文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)外套膜的组织学与组织化学研究

利用组织学和组织化学染色方法对文蛤外套膜进行了研究。结果表明 ,文蛤外套膜具有双壳贝类外套膜的典型结构特征 ,即由中央膜与边缘膜组成 ,边缘膜具有 3个突起。组织结构包括内外上皮层、结缔组织与肌纤维。不同部位的外套膜 ,其上皮细胞的形态结构、结缔组织与肌纤维含量等有差异。上皮细胞与结缔组织中分布有几种不同类型的粘液分泌细胞。组织化学研究结果显示 ,缘膜突起上皮细胞内含有丰富的糖类。分泌细胞内含物中含有丰富的糖类和少量的 RNA,同时在分泌细胞检测到较强的

“红肉病”文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)中发现的3种病毒样颗粒

本文报道了在患“红肉病”文蛤组织中发现的 3种病毒样颗粒。 1种主要存在于鳃上皮下的结缔组织中 ,呈球形或椭球形 ,大小 (5 0～ 6 0 ) nm× (5 0～ 110 ) nm,无囊膜包裹。另 1种为球形 ,直径 16 0～ 180 nm,有囊膜 ,存在于外套膜上皮细胞及结缔组织细胞质中。第 3种存在于消化盲囊上皮细胞质内 ,为无囊膜包裹的球形病毒样颗粒 ,直径为 5 0～ 80 nm。

斧文蛤(Meretrix lamarchii)形态性状对体质量的影响效果分析

从湛江东海岛斧文蛤野生群体随机取200个2龄个体,测量壳长(SL)、壳宽(SW)、壳高(SH)、韧带长(Li L)、小月面长(Lu L)和体质量(W)6个性状,计算性状间的相关系数;以壳性状为自变量、体质量为依变量,采用通径分析方法计算壳性状对体质量的通径系数、决定系数,建立回归方程。结果显示,壳长、壳宽、壳高、韧带长与体质量极显著相关(P<0.01),小月面长与体质量相关不显著(P>0.05)。壳长、壳宽、壳高对体质量的直接影响均达到极显著水平(P<0.01),韧带长对体质量的直接影响较小,相关不显著(P>0.05);壳长对体质量的直接效应和间接效应均最大,是影响体质量的最重要因素。采用逐步回归分析方法建立了形态性状对体质量的多元回归方程YW=-126.784+1.249XSL+2.036XSW+0.911XSH,为斧文蛤选种提供了理论依据和测度指标。

文蛤(Meretrix meretrix)4个壳色花纹品系的遗传差异分析

应用AFLP技术对文蛤红壳(RS)、黑斑(BS)、细纹(TC)、暗纹(DF)4个壳色花纹品系进行遗传差异分析。利用15对AFLP引物组合对4品系共128个个体进行了PCR扩增和电泳检测,共得到789个位点,总多态位点比例90.75%。Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数显示,4个品系的遗传多样性大小依次为BS品系>RS品系>DF品系>TC品系。AMOVA分析表明,79.45%的变异来自品系内,品系间的变异只占20.55%。聚类分析结果表明,4个品系间存在较明显的遗传差异,TC品系与其他品系的遗传差异最大,DF品系和RS品系的遗传差异相对较小。发现1个TC品系特有的AFLP标记,其出现频率为1.000,可作为品系鉴别的特征性标记。

沉积物暴露条件下文蛤Meretrix meretrix对重金属Cu、Pb的富集动力学研究

应用半静态双箱动力学模型室内模拟了沉积物暴露条件下文蛤Meretrix meretrix对Cu、Pb的生物富集,通过对富集与排出过程中文蛤体内重金属污染物的动态监测和对富集与排出过程监测结果的非线性拟合,得到了文蛤富集重金属的吸收速率常数K1、排出速率常数K2、生物富集因子BCF(bioconcentration factors)、生物学半衰期B1/2等动力学参数。拟合结果得到的Cu、Pb各动力学参数分别为,K1为4.6333—72.3754;K2为0.0512—0.0798;BCF为60.7646—1414.9634;B1/2为8.69—13.55。对模型的拟合优度检验结果显示,沉积物暴露条件下文蛤对重金属Cu、Pb的生物富集数据符合双箱模型,模型的拟合优度良好。比较结果得出,吸收速率常数K1及生物富集因子BCF均随着外部水体金属暴露浓度的增大而减小;文蛤对Cu富集能力大于Pb;Cu在文蛤体内的生物学半衰期B1/2大于Pb;理论平衡状态下生物体内Cu、Pb的含量CAmax随着外部水体中金属暴露浓度的增大而增大,且呈显著正相关,实验结果表明沉积物暴露条件下双箱动力学模型在一定条件下是可以应用于文蛤的富集动力学研究的,仍需要进一步开展不同条件下实验研究分析。

文蛤(Meretrix meretrix)铁蛋白的重组表达及其组织表达特征分析

构建了文蛤铁蛋白的重组表达质粒pGEX-4T-1-MmeFer,在大肠杆菌Escherichiacoli中获得了重组蛋白,经酶解和质谱鉴定该蛋白为重组文蛤铁蛋白(rGST-MmeFer),切除GST标签的重组文蛤铁蛋白(rMmeFer)具有氧化和吸收铁离子的功能。利用rGST-MmeFer制备了兔抗文蛤铁蛋白的多克隆抗体,进而利用Western blot的方法对文蛤铁蛋白的组织表达分布进行了研究。结果表明,铁蛋白在文蛤各组织中均有分布,其中消化腺中表达量最高,足中表达量最低。此外,利用实时定量PCR分析了文蛤消化腺、外套膜和鳃组织中铁蛋白mRNA的表达,发现铁蛋白mRNA在外套膜中表达量最高,消化腺次之,鳃中表达量最低,差异达到显著水平(P<0.05)。上述结果为进一步研究铁蛋白参与贝类贝壳形成的分子机制奠定了基础。

文蛤Meretrix meretrix血细胞形态与分类

光镜观察湛江南三地区文蛤血细胞的形态与结构特征,并进行分类。按细胞大小、形态和结构特征可将文蛤血细胞分为4类:透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞和淋巴细胞。细胞直径有统计学上显著性差异(P<0.05),分别为10.11±0.44μm、10.99±0.32μm、9.63±0.41μm和9.22±0.25μm。透明细胞是血细胞中的主要成分,细胞质中无颗粒;小颗粒细胞的细胞质中存在大量细小颗粒;大颗粒细胞细胞质中的颗粒直径有1.0～2.5μm;淋巴细胞是血细胞中含量最少的,有很高的核质比,大约为0.5。

文蛤MERETRIX MERETRIX LINNAEUS工厂化人工育苗试验

文蛤的人工催产、浮游幼虫培育和稚贝水泥池培养试验结果表明：（1）用阴干与流水结合的方法刺激亲贝能获得理想俏产效果。（2）在水温28．0～29．1℃，比重1．0160—1．0187，pH值8．2－8．4条件下，用亚心形扁藻作文蛤D幼的开口饵料和壳顶幼虫饵料，生长快（日增长高达24．5μm）、成活率高（72．3％）、浮游期短（仅5－6天）。（3）文蛤眼点功出水泥池无砂底附苗试验获得成功，且单位面积附苗量高达433．3万颗／m2。（4）室内水泥池铺砂培养文蛤稚贝，前期生长快，但当壳长达300μm后，稚贝分泌一种粘液，生长和成活受到影响。建议定期翻池洗苗，当壳长达500μm后尽早将苗移至池塘内砂滩培养。