利用优化的显微技术观察和定位Merm1/Wbscr22在人肺癌细胞NCI-H1299中的表达

目的优化细胞免疫荧光染色技术结合激光扫描共聚焦显微镜技术的实验步骤,观察并定位Merm1/Wbscr22在人肺癌细胞NCI-H1299中的表达,以期对后续深入研究Merm1/Wbscr22的分子功能提供技术支持。方法采用Western blot及细胞免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜技术观察Merm1/Wbscr22在NCI-H1299细胞的表达与定位,改进并优化免疫荧光染色实验步骤。结果 Merm1/Wbscr22蛋白在NCI-H1299细胞内过量表达,并定位于细胞核内。细胞免疫染色步骤显著地影响Texas Red-鬼笔环肽的非特异性染色及F-actin、Merm1/Wbscr22、细胞核DNA染色荧光的强度。结论 结合细胞免疫荧光染色技术与激光扫描共聚焦显微镜技术可以清楚地观察Merm1/Wbscr22在人肺癌细胞NCI-H1299的表达与定位,该技术的最优实验步骤是细胞固定、透膜、封闭、Texas Red-鬼笔环肽标记F-actin、一抗结合、二抗结合、DAPI标记细胞核DNA,最后共聚焦显微镜成像,这样既能减少Texas Red-鬼笔环肽的非特异性染色,各组分荧光强度又足够清晰利于观察。

定量PCR分析人肺癌细胞NCI-H1299基因表达的内参基因选择

目的评价实时荧光定量PCR分析人肺癌细胞NCI-H1299中Merm1/Wbscr22基因表达时6个候选内参基因表达的稳定性,筛选最适的内参基因。方法选择ACTB、B2M、GAPD、HPRT1、RPL32及TBP作为候选内参基因,利用geNorm,NormFinder及RefFinder程序分析实时荧光定量PCR数据,评价6个候选内参基因在NCI-H1299细胞株中的表达稳定性,筛选最适内参基因,同时观察选用不同内参基因对目的基因相对表达量分析的影响。结果 6个候选内参基因在NCI-H1299细胞株中的表达稳定性由强至弱排序为:RPL32>HPRT1>GAPD>ACTB>TBP>B2M,选择不同内参基因影响目的基因Merm1/Wb-scr22的相对表达量。结论 RPL32+HPRT1是实时荧光定量PCR分析人肺癌细胞NCI-H1299中Merm1/Wbscr22基因表达的最适内参基因组合。

人源肾细胞(HEK293T)蛋白LGALS1真核表达载体的构建

目的:扩增LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22三种蛋白的基因,构建其真核表达载体,为后续蛋白互作、毒力因子分析等实验奠定基础。方法:根据毒力蛋白基因序列,使用premier 5.0软件设计了三对特异性引物用于基因扩增。以HEK293T细胞中提取出的RNA反转录出的cDNA为模板,PCR法扩增三种基因LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22,连接至pMD19-T载体,构建出pMD19-T-LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22,分别经Nde I和BamH I,EcoR I和Nde I,BamH I和EcoR I双酶切后连接到pGBKT7真核表达载体中,构建出pGBKT7-LGALS1、pGBKT7-ZFP36L2、pGBKT7-WBSCR22。结果:目的基因LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22扩增成功,pMD19-T-LGALS1、pMD19-T-ZFP36L2、pMD19-T-WBSCR22连接成功,双酶切成功,真核表达载体pGBKT7-LGALS1构建成功,pGBKT7-ZFP36L2、pGBKT7-WBSCR22构建失败。结论:真核表达载体pGBKT7-LGALS1成功构建,为后续实验的进行提供了便利。pGBKT7-ZFP36L2、pGBKT7-WBSCR22构建失败,积累了丰厚的实验经验。