补肾法诱导间充质干细胞向神经方向分化研究

目的 在干细胞具先天之精属性新理论指导下 ,探讨补肾中药龟板对间充质干细胞的体外诱导作用。方法 体外分离培养间充质干细胞 ,以龟板水煎液对其进行体外诱导 ,免疫组化鉴定NSE、Nestin、GFAP等标志。结果 龟板可体外诱导间充质干细胞转分化为神经干细胞 ,但还没有被诱导为神经元样细胞与星形胶质细胞。结论 补肾法可促进干细胞之间的相互转换 ,初步验证了干细胞具先天之精属性新理论。

胚胎期宫内移植骨髓间充质干细胞对显性脊柱裂胎鼠脊髓骨形态发生蛋白4表达水平的影响研究

背景骨形态发生蛋白4(BMP4)在神经管背腹轴模式的形成、细胞凋亡以及干细胞的分化和转化过程中均起重要作用,通过转基因的方法将BMP4基因转入骨髓间充质干细胞(MSCs)后,是否能分泌一定水平的BMP4,使干细胞既能替代受损神经元,又具有重建侧支循环和神经保护作用,一直是未解决的热点问题。目的观察MSCs移植前后,显性脊柱裂胎鼠脊髓组织中BMP4表达情况。方法于2017年11月2018年10月,在哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心购买Wistar实验大鼠50只(雄鼠8只,雌鼠42只),出生后10 d的Wistar大鼠5只留作干细胞来源。常规条件下饲养,午夜合笼,确认交配。利用致畸药物维甲酸建立显性脊柱裂胎鼠模型,利用显微外科注射技术对胎鼠进行MSCs移植治疗。将同一只孕鼠所孕的胎鼠分为维甲酸无畸形组(10只)、脊柱裂畸形组(12只)、维甲酸无畸形干细胞移植组(10只)、畸形干细胞移植组(10只)和畸形空白移植组(8只)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测各组BMP4和拮抗剂Noggin mRNA表达情况。结果脊柱裂畸形组BMP4 mRNA表达水平高于维甲酸无畸形组,Noggin mRNA表达水平低于维甲酸无畸形组(P<0.05)。脊柱裂畸形组、畸形干细胞移植组和畸形空白移植组BMP4、Noggin mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中畸形干细胞移植组BMP4 mRNA表达水平高于脊柱裂畸形组和畸形空白移植组,Noggin mRNA表达水平低于脊柱裂畸形组和畸形空白移植组(P<0.05)。维甲酸无畸形组和维甲酸无畸形干细胞移植组BMP4、Noggin mRNA表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论BMP4与先天性显性脊柱裂畸形的发病机制有关;在MSCs移植治疗先天性脊柱裂畸形过程中可能通过上调BMP4 mRNA的表达而最终达到治疗的目的。

先天性显性脊椎裂胎鼠宫内干细胞移植新方法的建立

目的建立一种先天性显性脊椎裂胎鼠宫内干细胞移植的新方法。方法选择孕16、17、18天的雌性大鼠各30、30、26只,制备先天性显性脊椎裂胎鼠模型。采用胎仔外科、显微外科和显微注射技术,将转染绿色荧光蛋白基因的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植到脊椎裂胎鼠脊髓中。大鼠孕20天时剖腹、取胎,计算胎鼠成活率;制作胎鼠脊髓切片,荧光显微镜下观察胎鼠脊髓干细胞移植情况。结果接受手术的孕鼠86只,孕20天成活81只,成活率为94.2%。行干细胞移植的先天性显性脊椎裂胎鼠258只,共取出198只,成活率为76.7%(198/258),其中胎龄为16、17、18天的胎鼠成活率分别为72.1%(80/111)、77.3%(78/101)、87.0%(40/46)。荧光显微镜下观察胎鼠脊髓切片,可见呈现绿色荧光的MSCs;干细胞移植成活的胎鼠195只,成活率为98.5%(195/198)。结论成功建立先天性显性脊椎裂胎鼠宫内干细胞移植的新方法;该方法干细胞成活率较高,可用于神经管畸形治疗。

重组慢病毒介导STAT3过表达质粒转染促进显性脊柱裂胎鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的:观察重组慢病毒介导STAT3过表达质粒转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后,对显性脊柱裂胎鼠脊髓组织神经细胞转分化的影响。方法:给予维甲酸致畸建立显性脊柱裂胎鼠模型,利用显微外科注射技术对胎鼠进行干细胞移植治疗。分为空白对照组(12例),阴性对照组(10例)和实验组(11例),采用CCK-8,RT-PCR和Western-blot检测手段,测定干细胞增殖活性的OD值及每组STAT3,pSTAT3,神经标记物(GFAP,NSE,NF和Nestin)和凋亡相关因子(Caspase-8和Bcl-2)的表达情况。结果:在干细胞移植后通过CCK-8检测实验组在第8小时OD值达到峰值,之后逐渐下降,与空白对照组和阴性对照组相比有统计学差异(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组检测后的OD值高峰时间和峰值未见统计学差异。经过基因和蛋白双验证,实验组pSTAT3,GFAP,NSE,NF和Nestin表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),而STAT3 mRNA在实验组中的表达水平显著降低(P<0.05)。实验组中Caspase-8和Bcl-2在基因和蛋白两个层面的表达水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论:构建STAT3过表达质粒通过慢病毒介导的方法转染骨髓间充质干细胞,可以提高其向神经细胞转化的效率,为显性脊柱裂的治疗提供新的种子细胞。

先天性脊柱侧凸患者骨髓间充质干细胞差异表达microRNAs的鉴定分析

目的:分析先天性脊柱侧凸(CS)患者和健康人骨髓间充质干细胞中的差异microRNAs(miRNAs)表达谱。方法:获取CS患者(椎体形成障碍亚组、椎体分节障碍亚组)及健康对照组的骨髓,分离培养、鉴定骨髓间充质干细胞,提取总RNA后标记miRNAs,使用微阵列芯片技术检测三组受试者骨髓间充质干细胞中的miRNAs表达谱,并对差异miRNAs进行生物信息学分析,通过qRT-PCR技术对获得的差异miRNAs进行验证。结果:在椎体形成障碍亚组和健康对照组之间鉴定出29个差异表达miRNAs,在椎体分节障碍亚组和健康对照组之间鉴定出27个差异表达miRNAs。两组差异表达miRNAs的交集共有10个。生物信息学分析结果显示,细胞内信号转导、高尔基体部分和蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶激活物活性分别是生物过程、细胞定位和分子功能中最显著的富集项,黏蛋白型O-聚糖的生物合成是所涉及的最重要的信号通路。qRT-PCR成功验证了其中2个差异表达的miRNAs:miR-412-3p和miR-766-5p。结论:本研究成功构建了CS患者与健康人骨髓间充质干细胞中的差异miRNAs表达谱。这些差异表达的miRNAs可能对阐述CS的发病机制具有重要意义,并有助于建立早期诊断生物标志物。

共培养技术在耳软骨再生中的应用及展望

耳软骨组织工程是耳廓再造的重要发展方向,但存在种子细胞数量不足,单一培养模式下的纤维软骨形成和肥大等问题。软骨细胞和间充质干细胞的共培养模式可以克服单一培养模式的弊端。本综述通过对国内外应用在软骨组织工程的共培养研究进行概述,总结共培养体系对于软骨组织工程软骨形成的作用,分析直接共培养模式和间接共培养模式的特点,并讨论了其可能的机制和与其它促进转化因子的综合应用。

骨髓间充质干细胞对脊柱裂神经细胞凋亡影响

目的观察宫内移植骨髓间充质干细胞对脊柱裂子鼠神经细胞凋亡及p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响。方法将30只妊娠大鼠随机根据随机数字法分为对照组、脊柱裂组(建立脊柱裂模型)、移植组(建立脊柱裂模型+骨髓间充质干细胞移植),每组10只,造模成功后,在每组取16只子鼠进行研究。采用原位缺口末端标记法(TUNEL)法测定脊髓细胞凋亡。采用蛋白质印迹法(Western blot)和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定子鼠脊髓半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)、磷酸化-核因子-κB(p-NF-κB)、磷酸化-p38(p-p38)、p38、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)水平。应用SPSS 20.0统计软件分析。结果与对照组[(6.47±0.62)个]比较,脊柱裂组和移植组子鼠脊髓凋亡细胞数明显升高[(23.14±2.36)、(13.62±1.04)个,t=27.327、14.425,P<0.05],与脊柱裂组比较,移植组子鼠脊髓凋亡细胞数降低(t=12.648,P<0.05)。对照组比较,脊柱裂组和移植组子鼠脊髓Caspase-3、p-NF-κB、p-p38、bax水平升高(0.76±0.12、0.82±0.13、0.92±0.14、0.93±0.14;0.41±0.08、0.54±0.08、0.53±0.11、0.65±0.12,t=22.143,11.362;19.530,7.363;18.942,8.251;16.438,8.261,P<0.05),bcl-2水平明显降低(0.24±0.08、0.49±0.10,t=20.084、9.214,P<0.05);与脊柱裂组比较,移植组子鼠脊髓Caspase-3、p-NF-κB、p-p38、bax mRNA水平明显降低(1.51±0.24、1.84±0.23、1.83±0.25、2.13±0.18,t=28.536,13.254;30.657,15.326;37.526,16.426;28.536,15.426,P<0.05),bcl-2 mRNA水平明显升高(0.54±0.08,t=46.526,P<0.05)。结论宫内移植骨髓间充质干细胞可能通过抑制p38 MAPK信号通路降低脊柱裂子鼠神经细胞凋亡。

骨髓间充质干细胞在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的分化

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的存活与分化,探寻细胞替代治疗先天性脊椎裂的方法。方法用贴壁培养法进行大鼠MSC原代培养并传代,携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒转染第3代骨髓MSC。将转染的MSC注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中。母鼠孕20 d时取先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脱水后做冷冻切片,免疫荧光方法检测脊髓中EGFP阳性MSC中巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果骨髓MSC中CD90阳性细胞占99%,CD44阳性细胞占95%,不表达CD34。腺病毒-EGFP转染骨髓MSC的转染率为61%。致畸组显性脊椎裂胎鼠占64.3%。移植的MSC存在于脊髓表面或进入脊髓中,部分细胞变为长梭形或多角形。免疫荧光法检测结果显示移植到脊髓中的MSC可表达神经干细胞的标志物Nestin和神经胶质细胞的标志物GFAP。结论带有EGFP的MSC经细胞移植后能在胎鼠脊髓内存活,并能分化为神经干细胞和神经胶质细胞。

胚胎期骨髓间充质干细胞移植对先天性脊柱裂大鼠脊髓NGF和BDNF的表达及细胞凋亡的影响

目的 研究胚胎期骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)移植对显性脊柱裂胎鼠脊髓组织中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表达及细胞凋亡的影响.方法 建立全反式维甲酸致畸的显性脊柱裂大鼠模型,妊娠16d通过胎仔外科与显微注射相结合的方法将BMSC移植入胎鼠脊髓缺损部位,待胎鼠成活至妊娠21 d取脊髓,免疫荧光染色检测移植BMSC后脊髓缺损部位NGF和BDNF的表达,同时TUNEL染色法检测细胞凋亡的变化.结果 显性脊柱裂胎鼠BMSC移植后脊髓内BDNF、NGF的表达增强,而且BMSC移植区表达升高最显著,TUNEL染色显示BMSC移植组细胞凋亡明显减少.结论 胚胎期BMSC移植后改变脊柱裂病变区微环境,可能通过上调神经营养因子的表达,抑制细胞凋亡,从而促进脊柱裂神经损伤的修复.

Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12天神经管中的异常表达

目的探讨Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12d神经管及神经上皮干细胞中的表达情况。方法取畸形大鼠12d胚胎神经管组织，荧光实时定量PCR考察Chop及Grp78基因表达。另取12d正常大鼠胚胎，分离消化神经管行神经上皮干细胞培养。荧光实时定量PCR考察Chop及Grp78基因表达。结果先天性脊柱裂大鼠胚胎12d神经管内Chop基因及Grp78基因表达异常增高。神经上皮干细胞分化为神经元后Chop及Grp78基因的表达上调。结论Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12d神经管中表达异常增高，二者在神经上皮干细胞分化为神经元后表达上调，可能与内质网应激相关的凋亡有关。神经上皮干细胞培养培养体系稳定、高效，可以为胚胎早期发育提供实验模型。

紫绀及非紫绀型先心病患者来源的人骨髓间充质干细胞抗凋亡能力的比较

目的 对比紫绀型先心病（cyanotic congenital heart disease,C-CHD）和非紫绀型先心病（acyanotic congenital heart disease,A-CHD）患儿来源的骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）在乏氧环境下的抗凋亡能力并探讨其发生机制。方法 hMSCs取自C-CHD（C组）和A-CHD（A组）患儿（男女不限,0~5岁）,于体外乏氧环境下（1%O_2,5%CO_2,94%N_2）培养。以Annexin V/PI双染结合流式细胞技术对比两组细胞抵御缺血缺氧诱导细胞凋亡的能力;以Western blot法检测两组细胞中B细胞淋巴瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）,Bcl-2相关X蛋白（Bax）以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的含量。结果 Annexin V/PI双染结合流式细胞检测结果显示：在缺血缺氧环境下,C组细胞的早期凋亡率（P〈0.01）和总体凋亡率（P〈0.05）低于A组细胞。Western-blot检测结果显示：C组细胞的凋亡抑制基因Bcl-2的含量高于A组细胞（P〈0.05）,抗凋亡抑制基因Bax（P〈0.05）以及caspase-3（P〈0.05）的含量低于A组细胞。结论 C-CHD患者来源的hMSCs具有更好的抗缺血缺氧诱导的总凋亡及早期凋亡能力,这可能与其天然乏氧诱导的Bcl-2表达上调,Bax,caspase-3表达下调有关。

宫内移植骨髓间充质干细胞对显性脊柱裂胎鼠神经元重建的作用研究

目的胚胎期移植骨髓间充质干细胞（bonemarrowstemcell，BMSCs）至先天性脊柱裂模型胎鼠脊髓中，观察其在显性脊柱裂胎鼠脊髓中存活及分化情况，并探讨其对脊髓神经元修复的治疗潜能。方法利用胎仔外科和显微注射技术将绿色荧光蛋白（eGFP）转染的BMSCs分别在胚胎第16、17和18天移植到83只脊柱裂和20只正常大鼠胚胎中（groupE16、E17andE18），胚胎20d的胎鼠脊髓被取出并固定。经冰冻切片后，计数eGFP阳性细胞数目，并利用免疫荧光方法检测脊髓中eGFP阳性的BMSCs中神经干细胞（Nestin）、神经元（Neurofilament）和神经胶质细胞（GFAP）的分布与表达。结果本研究成功的将MSC在宫内移植入胎鼠体内，孕鼠的存活率为94％（81／86），胎鼠的存活率为78．1％（136／174）；实验中孕16d的胎鼠存活率为75．8％（91／120）低于孕·17d的80．6％（25／31）和孕18d的87．O％（20／23）。计数脊髓中eGFP阳性细胞数，范围在166～735个／根，其中P0代MSCs存活率最低，为10．8％；P3～6代为22．6％、P10～14代为20．1％；P10～14代MSC在母鼠孕16d时移植得到最佳分化率；统计eGFP阳性细胞表达Nestin、Neurofilament和GFAP的阳性率分别为4％～5％、1％～2％和5％～7％。结论BMSCs移植到显性脊柱裂胎鼠脊髓中能够存活，并在脊髓中表达Nestin、Neurofilament和GFAP，提示移植骨髓间充质干细胞具有向神经干细胞、神经元和神经胶质细胞分化的可能。

慢性缺氧对人类骨髓间充质干细胞影响的实验研究

目的研究长期慢性缺氧对紫绀型先天性心脏病患儿自体骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)生物学行为的影响。方法通过血气分析紫绀组和非紫绀组骨髓的氧浓度,检测骨髓血BMSCs含量,评估细胞增殖能力,以及BMSCs定向诱导为成骨、成脂及成软骨细胞的能力。给予缺氧缺血清处理后评估BMSCs的抗凋亡能力。结果紫绀组患儿的骨髓氧分压较非紫绀显著降低(P<0.01),两组骨髓的BMSCs的含量无统计学差异,但紫绀组BMSCs的增殖能力,成骨、成脂、成软骨分化能力及抗凋亡能力较非紫绀组显著降低(P<0.05)。结论长期慢性缺氧能明显降低骨髓的氧浓度,并显著减弱BMSCs的增殖、多向分化及抗凋亡能力,但对BMSCs的含量无影响。

胎儿脊柱裂的致病因素与治疗的研究进展

随着影像学的发展,产前胎儿神经系统发育异常检出率不断升高,脊柱裂也被不断检出,然而对于发现胎儿脊柱裂后是否应终止妊娠尚无统一标准,以往对于胎儿脊柱裂的致病因素及治疗相关进展的文献报道比较分散。本文主要针对胎儿脊柱裂的致病因素、治疗相关进展以及是否终止妊娠等问题作一综述,并提出相应诊疗策略,以期为临床治疗提供参考。