中华绒螯蟹重组金属硫蛋白的原核表达与分离纯化

金属硫蛋白(MT)由于其独特的结构和性质,而成为潜在的医用蛋白资源。本研究将重组中华绒螯蟹金属硫蛋白基因cDNA克隆入原核表达载体pET-GST,转化大肠杆菌BL21。重组蛋白以可溶和包涵体两种形式表达。根据金属硫蛋白的特性,优化了表达条件。Western blot证实了表达产物的正确性,用锌柱亲合层析得到高纯度的重组金属硫蛋白。为以后金属硫蛋白的生物学功能研究奠定了良好的基础。

棉铃虫普通气味结合蛋白Ⅱ基因的表达及鉴定

通过PCR扩增的方法获得了棉铃虫普通气味结合蛋白Ⅱ (GOBP2 Harm)基因成熟蛋白阅读框序列 ,构建了GOBP2 Harm原核表达载体pGEX GOBP2 Harm ,并成功地在大肠杆菌中进行了表达。SDS PAGE分析表明 :大部分GOBP2 Harm重组蛋白形成不溶性的包涵体 ,超声波破碎大肠杆菌细胞后 ,在上清液中能检测到少量的可溶性GOBP2 Harm蛋白。为了获得大量纯化的可溶性目的蛋白 ,我们对包涵体进行了溶解和重折叠 ,并通过亲合层析法进行了纯化。纯化产物能与多音天蚕(Antheraeapolyphemus)GOBP抗血清发生交叉反应 ,证实表达产物属于昆虫普通气味结合蛋白。

美洲大蠊变应原CrPI的表达、纯化与免疫学特性鉴定

以阳性噬菌体克隆为模板 ,通过PCR扩增出目的基因片段并克隆入T载体 ,经测序证实为美洲大蠊Periplanetaamericana变应原CrPI后 ,将该基因亚克隆入表达载体pGEX 5X 1。美洲大蠊变应原CrPI在大肠杆菌中得到高效表达 ,但主要以包涵体形式存在于沉淀中。目的蛋白溶于 6mol L盐酸胍并经稀释复性后 ,经GlutathioneSepharoseTM 4B亲和层析 ,纯度达 90 %以上。以蟑螂过敏病人血清进行免疫印迹检测 ,结果显示重组变应原具有良好的IgE结合活性。

屋尘螨重组变应原Der p 2的表达、纯化及免疫学活性鉴定

目的大量诱导表达含pET24a-Derp2质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,经包涵体洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用梯度复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Western blot方法分析Derp2重组蛋白的免疫学特性。纯化后的融合蛋白Derp2具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。

钙蛋白酶抑制蛋白功能结构域Ⅳ在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗血清的制备

为了研究钙蛋白酶系统在细胞发育及其它生理过程的功能 .应用 PCR从鼠钙蛋白酶抑制蛋白 ( calpastatin) c DNA中扩增了保守的具有功能的结构域 ( 40 4 bp) ,克隆于 p GEX- KG载体 .重组质粒 p GEX- Calp4在大肠杆菌中经 IPTG诱导可表达分子量约 4 5 k D融合蛋白 GST- Galp4 .诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽 - Sepharose4 B亲和层析柱得到纯化的 GST- Calp4融合蛋白 ,纯度达电泳纯 .纯化的 GST- Calp4免疫兔 8周后 ,抗血清的效价达 1∶ 64 .Western- blot分析表明制备的抗血清确实可以与肌细胞中分子量为 1 4 0 k D左右蛋白 (亦即完整 calpastatin)发生特异的免疫交叉反应 。

重组hKGF2原核表达载体的构建及其蛋白质的纯化

角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor2,KGF2)是新近发现的成纤维细胞生长因子家族中的一员,又称FGF10,是上皮细胞特异性的促有丝分裂剂,具有广泛的应用前景。为构建其高效原核表达体系,用RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取成熟hKGF2cDNA,进行T-A克隆;经测序后,构建pET-30a(+)-hKGF2重组表达载体,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。IPTG诱导表达后,重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定为高效可溶性表达。镍亲和层析(Ni+-NTA)一步法纯化后获得纯度达95%以上的目的蛋白,生物活性研究表明,重组hKGF2能有效促进人胚胎肾上皮细胞的增殖。

分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 表达及纯化人分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子 (secretedformTNF relatedactivation in ducedcytokine,sTRANCE)蛋白。方法 将sTRANCE结构基因重组到含麦芽糖结合蛋白 (MBP)的融合蛋白原核表达载体 pMAL c2x中 ,在大肠杆菌中进行表达。 结果 经IPTG诱导表达出的MBP sTRANCE融合蛋白相对分子质量约 70 0 0 0 ,并经Westernblot分析证实。用直链淀粉琼脂糖凝胶 (amyloseresin)亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。结论 成功地获得sTRANCE蛋白 ,为进一步研究其生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性打下了基础。

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果 :重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在 ,但以不可溶性形式为主 ,表达量随诱导时间延长而增加 ,在诱导 8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的 32 %。经亲和层析获得较高纯度的人MT 1E融合蛋白。结论 :利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT 1E融合蛋白 ,为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。

p21^(Ha-ras)原核表达载体的构建、表达及纯化的研究

目的:构建PET-28a(+)-Ha-ras原核表达质粒,并表达、纯化得到p21ras蛋白,为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及p21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定基础。方法:培养人肝癌细胞株7703,提取总RNA,通过RT-PCR特异扩增出Ha-ras cDNA,然后应用TA克隆策略将纯化后的Ha-ras插入至中间载体pMD18-T vector中得到重组质粒PMD-18T vector-ras,重组质粒PMD-18Tv ector-Ha-ras经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的Ha-ras cDNA,将PET-28a(+)同样经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到与ras cDNA相同的黏性末端的线形质粒片段,将具有黏性末端的ras cDNA与酶切后的PET-28a(+)定向连接,构建出重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras,经酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的PET-28a(+)-Ha-ras转入感受态BL-21(DE3)中诱导表达,利用组氨酸"标签"(His-Tag)对p21ras进行金属螯合亲和层析纯化。结果:测序分析证实,克隆入PET-28a(+)的Ha-ras序列与Genbank登录号为"NM_005343"的Ha-ras cDNA序列一致,将重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。SDS-PAG和蛋白纯化结果表明,PET-28a(+)-Ha-Ras在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的p21ras蛋白。结论:成功构建了原核表达载体PET-28a(+)-Ha-ras,并经表达、纯化得到活性形式的p21ras蛋白,从而为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及P21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定了基础。

兔源抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、抗体的制备及初步应用

为了原核表达兔源抗凋亡蛋白Bcl-2,并诱导表达纯化该蛋白后制备多抗,采用RT-PCR扩增Bcl-2编码序列,并将该序列克隆至pET-32a(+)载体,获得重组pET-32a-Bcl-2质粒转化BL21(DE3),筛选最佳表达条件,通过亲和层析纯化目的蛋白质,最后经Western blot鉴定后免疫小鼠。结果显示,成功扩增Bcl-2编码序列并构建了pET-32a-Bcl-2表达载体;SDS-PAGE结果显示,在16℃,5 h,0.5 mmol/L IPTG的表达条件下,重组蛋白Bcl-2能够高效可溶性表达;Western blot结果表明纯化后的表达产物为高纯度的Bcl-2重组蛋白,将该蛋白质免疫小鼠后获得了特异性抗体,该抗体能够特异性识别重组Bcl-2蛋白,并应用该抗体鉴定RK13-B细胞中Bcl-2蛋白的过表达。

NADH-细胞色素b5还原酶在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

为了探讨 NADH-细胞色素 b5还原酶基因突变引起遗传性高铁血红蛋白血症的分子病理机制 ,研究突变型 ( b5R)蛋白结构和功能的关系 ,用基因重组技术将野生型和突变型 ( C2 0 3Y) b5Rc DNA克隆于 p GEX- 2 T载体 ,在大肠杆菌 BL2 1中诱导表达 .Western印迹鉴定所表达的蛋白为GST- b5R融合蛋白 .应用谷胱甘肽 - Sepharose 4B亲和层析 ,还原型谷胱甘肽洗脱得到纯化的GST- b5R和 GST- b5RC2 0 3Y融合蛋白 .比较 GST- b5R和 GST- b5RC2 0 3Y酶活性及稳定性 ,发现野生型和突变型的酶活性基本相同 .但与野生型酶相比 ,突变型酶对热的稳定性较差 ,对胰蛋白酶更加敏感 .结果提示 ,C2 0 3Y突变可引起蛋白质二级结构改变而导致酶的稳定性下降 .

人肿瘤抗原基因Delta-like4(DLL4)可溶性表达、纯化及鉴定

目的研究克隆肿瘤抗原人DLL4基因,与原核表达载体可溶性融合表达、分离纯化及其鉴定,并计划将其应用于DLL4特异性肺癌肿瘤疫苗研究过程中的抗血清滴度检测.方法采用PCR方法扩增DLL4多核苷酸序列,克隆入pMD-18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pGEX-KG原核表达载体,获得pGEX-KG-hDLL4载体.以该载体转化E.coli菌株BL21(DE3),IPTG诱导其表达,裂解大肠杆菌,以GSTrap亲和层析柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hDLL4基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因hDLL4.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hDLL4.结论融合蛋白GST-hDLL4在25℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L条件下诱导表达,以GSTrap亲和层析柱纯化,获得纯化融合蛋白.采用SDS-PAGE,Western Blot的方法可检测到目的可溶性融合蛋白GST-hDLL4的表达.

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化。方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI。在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定。结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrap Kit成功纯化目的蛋白。ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性。结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。

p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化

为了研究错义突变对ｐ１６功能的影响，应用ＰＣＲ体外定点突变方法对ｐ１６ｃＤＮＡ进行体外定点突变，并将野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＸ－５Ｔ载体，在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定确证表达．而后用谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化野生型和突变型ｐ１６融合蛋白．得到了第４８位密码子ＣＣＧ（Ｐｒｏ）→ＣＴＧ（Ｌｅｕ）突变的ｐ１６－Ｐ４８突变体，并在大肠杆菌中表达了４２ｋＤ的ＧＳＴ－ｐ１６和ＧＳＴ－ｐ１６Ｐ４８Ｌ融合蛋白．

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.

TAT-凋亡素基因重组质粒的构建、蛋白的表达纯化及体内活性实验

目的构建TAT-凋亡素(TAT-Apoptin)质粒并提取融合蛋白,为进一步研究该蛋白功能奠定基础。方法PCR合成TAT-Apoptin基因,与pTYB2质粒连接后转入Rosetta菌,经IPTG诱导表达,几丁质亲和层析一步纯化目的蛋白,用昆明小鼠H22动物模型检测活性。结果克隆载体经过PCR筛选、测序鉴定,其核苷酸片段长度和序列与预期序列相符,诱导后融合蛋白出现在上清中,纯化出的TAT-Apoptin蛋白具有明显的抗肿瘤活性。结论该实验所构建的重组质粒pTYB2／TAT-Apoptin经诱导表达出了可溶性目的蛋白TAT-Apoptin,纯化后具有明显的生物活性,为TAT-Apoptin蛋白的进一步研究奠定了基础。

人源His-talin1原核表达载体的构建及其蛋白表达

目的克隆人源talin1 cDNA,构建其高效原核表达载体,并纯化得到高纯度His-talin1融合蛋白。方法 PCR法扩增talin1基因并连接到原核表达载体pET32a(+),筛选和测序鉴定阳性克隆。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和亲和层析分离纯化表达产物,对纯化的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果成功扩增了2.4kb的talin1基因,构建了pET32a(+)-talin1重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达出His-talin1融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot方法 ,验证了高纯度纯化的融合蛋白。结论建立了高效稳定的His-talin1表达体系,为进一步研究Talin1蛋白的结构及其与P-selectin之间的关系打下基础。

梅毒螺旋体TpN17抗原的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达梅毒螺旋体Tp N17抗原,通过亲和层析方法进行纯化,获得纯度较高的Tp N17抗原,利用该抗原建立梅毒诊断血清学方法。方法:将化学合成的Tp N17基因序列,克隆到p ET 22b质粒并转化到大肠杆菌BL21菌株中进行IPTG的诱导表达。利用Ni2+亲和层析柱对表达抗原进行纯化。结果:对插入片段进行测序,证实该序列结果与合成序列一致,并在大肠杆菌中成功表达Tp N17抗原,通过亲和层析获得纯度较高的目的抗原。结论:本研究中构建的大肠杆菌重组表达载体可有效的表达Tp N17抗原,经纯化后的抗原,可有望进一步应用于梅毒感染的血清学检测试剂盒的研发。

人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD 2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法:PCR扩增不含前导序列的HBD 2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD 2-cDNA),利用B g lⅡ和B amHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD 2-cDNA的克隆载体,利用N colⅠ和H indⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET 32-nsmHBD 2-cDNA,在大肠杆菌中BL 21(DE 3)中诱导表达含HBD 2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD 2多肽。采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD 2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD 2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD 2-cDNA几乎不含可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分。重组HBD 2对E.coli K 12 D 31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/m l时,90%细胞的生长被抑制。结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD 2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD 2多肽的原核高效表达。

家兔MT-I基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与分离

采用 RT- PCR方法扩增镉诱导后的家兔肝脏金属硫蛋白 - I(Metallothionein- I,MT- I)基因的 c DNA全长 ,克隆入原核融合表达载体 p QE4 0 ,转化大肠杆菌 M15。菌落印迹法检测阳性菌株 ;Western blotting分析重组融合蛋白的表达方式 ;经 SDS- PAGE电泳后 ,Im age Master VDS software分析融合蛋白诱导表达条件 ;并采用 Ni-NTA agarose纯化融合蛋白。结果发现 ,重组融合蛋白在原核细胞中表达存在可溶和不可溶 (包涵体 )两种形式 ,表达量随 IPTG诱导时间延长而增加 ,9h达高峰 (占菌体不溶性蛋白总量的 5 7.4 % ) ,经 Ni- NTA亲合层析纯化得到重组融合蛋白 。