耐紫杉醇肺癌细胞BNX动物模型的建立

目的建立一种耐药性稳定的人肺癌BNX小鼠皮下移植瘤模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法将体外培养的对数生长期的肺癌耐药细胞株A549-Taxol,接种在免疫缺陷小鼠的皮下,形成肿瘤,采用肿瘤组织块或肿瘤组织原代培养的细胞,分别于动物皮下接种致瘤;体内外交叉进行致瘤,提高耐药细胞株A549-Taxol的致瘤率和缩短致瘤时间。通过免疫组化鉴定该耐药细胞的特性。用MTT法检测细胞的耐药指数。结果耐药细胞接种于SCID小鼠4个月后在皮下形成肿瘤灶。用该肿瘤组织块或细胞悬液移植于SCID小鼠,通过反复3次后,细胞生长速度变快,2个月后皮下即可形成肿瘤。将该细胞移植于BNX小鼠,以同样的方法将瘤组织体内外交叉进行致瘤,最终BNX小鼠种植成功率达到80%。致瘤时间为3周。耐药细胞和组织块P-gp170、GST-π和MMP-7均高表达。A549-Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代A549细胞的520倍。结论初步建立了人肺腺癌耐药细胞(A549-Taxol)的动物模型,为肺癌临床个体化治疗及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台。

A549/MTX对映体耐药细胞的裸鼠荷瘤模型的建立

目的利用L型和D型氨甲喋呤(MTX)对映体分别建立人肺腺癌A549细胞株裸鼠耐药模型,为进一步揭示MTX对映体体内活性差异的原因提供实验平台。方法裸鼠皮下分别接种A549、耐药细胞株A549/L-MTX、A549/D-MTX各6×106个/0.2ml,观察肿瘤生长特性;瘤体原代培养后四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测耐药指数(resistance index RI);免疫组化(IHC)检测ki-67、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein1,MRP1)、survivin变化。结果从肿瘤生长曲线上看瘤体积三者差异有统计学意义(P<0.05),A549/L-MTX/nude组体积更小。A549/L-MTX/nude移植瘤RI为4.9,为低度耐药,A549/D-MTX/nude移植瘤RI为14.5,为中度耐药。A549/L-MTX/nude相关蛋白总体表达低于A549/D-MTX/nude,两者表达差异有统计学意义(P均<0.05)。结论成功建立对MTX两种对映体耐药的A549细胞株裸鼠肿瘤模型,且两种耐药细胞具有不同耐药特性,为研究MTX对映体体内抗肿瘤活性差异提供了较好的实验平台。

耐药乳腺癌免疫治疗的实验研究

目的:探讨耐药乳腺癌抗原负载的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合培养后对同种乳腺癌荷瘤小鼠的可能治疗机制。方法:分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为DC和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC(AP-DC),分别将DC与CIK细胞共培养(AP-DC+CIK组、DC+CIK组),将细胞经尾静脉注入裸鼠体内,观察不同组荷瘤标本中MDR1的表达、肿瘤细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果:AP-DC+CIK组、DC+CIK组、CIK组及生理盐水组MDR1/β-actin比值分别为0.14、0.57、0.81及0.98。生理盐水组、CIK组、DC+CIK组和AP-DC+CIK组平均凋亡指数差异有统计学意义(P<0.001)。各组Bcl-2及Bax蛋白表达的OD值差异有统计学意义(P<0.01),Bcl-2/Bax值AP-DC+CIK组<DC+CIK组<CIK组<生理盐水组。结论:经耐药乳腺癌抗原负载的DC与CIK共同作用后,诱导同种乳腺癌细胞凋亡强于单纯DC与CIK共同作用后及单独CIK的治疗效果。

顺铂诱导三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型的建立

目的建立一种耐药性稳定的三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法采用顺铂(DDP)低剂量诱导及体内外交叉致瘤结合的方法建立三阴性乳腺癌耐药小鼠模型;MTT法检测细胞耐药特性;实时荧光定量PCR法分析耐药相关基因MDR1、BCRP、MMP7及GST-π表达差异;免疫组化分析耐药相关蛋白P-gp、BCRP、MMP7表达差异;蛋白印迹法检测磷酸化Akt(phosphorate-Akt,p-Akt)和总Akt(total-Akt,t-Akt)蛋白表达;小动物成像检测观察肿瘤生长情况。结果 MTT显示建立的三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型的耐药指数为12.84;耐药小鼠肿瘤组织中MDR1、BCRP、MMP7、GST-π基因mRNA的表达量及P-gp、BCRP、MMP7蛋白的表达量均高于非耐药小鼠(P<0.01);Western blot显示,耐药小鼠肿瘤组织的p-Akt蛋白表达明显高于非耐药小鼠,t-Akt蛋白表达没有差异。非耐药小鼠与耐药小鼠肿瘤组织生长速度未见明显区别(P>0.05)。分别给予这两种模型小鼠相同剂量的DDP治疗后,耐药小鼠对DDP的敏感性明显低于非耐药小鼠(P<0.01)。结论初步建立了三阴性乳腺癌耐药4T1小鼠模型,为三阴性乳腺癌临床个体化治疗及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台。

裸小鼠人肝癌原位移植多药耐药模型的形态学研究

目的建立裸小鼠人肝癌原位移植多药耐药模型，探讨其生物学特征及耐药机制。方法裸小鼠人肝癌（Bel-7402）原位移植，用阿霉素腹腔注射诱导耐药，观察其病理形态学特征，采用荧光定量RT．PCR检测多药耐药基因MDR1mRNA在肝癌组织中表达。以流式细胞仪检测癌细胞MDR1基因产物P-糖蛋白（Pgp）的表达，并通过免疫组化和激光共聚焦显微成像系统对Pgp进行细胞定位及形态观察。结果移植瘤组织形态及生物学行为符合人肝癌特征，实验组MDR1mRNA表达量在1．4×10^3～3．6×10^6copy／μgRNA，阳性率达70．00％，PgP表达为75．45％±5．67％；而对照组MDR1mRNA表达阴性，Pgp表达阳性率为4．25％±1．28％（P〈0．01）。形态学观察显示Pgp大多位于细胞膜。结论裸小鼠人肝癌原位移植模型在形态及生物学特征上能高度模拟人肝癌。阿霉素在体内主要通过诱导人肝癌细胞多药耐药MDR1mRNA基因及影响功能蛋白Pgp的表达。获得耐药性。

MK-2206联合顺铂对乳腺癌4T1/DDP移植瘤耐药性的影响

目的探讨蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抑制剂MK-2206联合顺铂对三阴性乳腺癌4T1顺铂耐药(4T1/cisplatin,4T1/DDP)移植瘤耐药性的影响。方法采用顺铂(cisplatin,DDP)低剂量诱导及体内外交叉致瘤相结合的方法建立三阴性乳腺癌4T1/DDP耐药小鼠移植瘤模型,给予DDP腹腔注射(0.3 g/L,1次/d)单独或联合MK-2206灌胃(12 g/L,1次/周)治疗。给药28 d后处死小鼠,小动物成像检测观察肿瘤生长情况;Western blot法检测肿瘤组织中磷酸化Akt(phosphorate-Akt,p-Akt)和总Akt(total-Akt,t-Akt)蛋白水平变化;免疫组织化学法分析耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)、基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)表达差异。结果建立的三阴性乳腺癌耐药小鼠模型达中等耐药程度。建立非耐药小鼠与耐药小鼠肿瘤组织生长速度未见明显区别(P>0.05)。分别给予这两种模型小鼠相同剂量(0.3 g/L)的DDP治疗后,耐药小鼠对DDP的敏感性低于非耐药小鼠(P<0.01)。将MK-2206(12 g/L)与DDP(0.3 g/L)联合应用后小鼠肿瘤较单独应用DDP缩小,且可降低P-gp、BCRP、MMP7蛋白的表达(均P<0.05),并降低Akt蛋白磷酸化水平(P<0.01)。结论 MK-2206联合顺铂能够逆转4T1/DDP移植瘤耐药性,且与抑制Akt蛋白磷酸化相关。

采用体内实验探讨IL-17A促进卵巢癌腹腔种植瘤顺铂耐药的机制

目的探讨IL-17A促进卵巢癌(OVCA)腹腔种植瘤顺铂(DDP)耐药的体内机制。方法以C57BL/6遗传背景的野生型(W T)小鼠和IL-17A-deficien(t IL-17A-/-)小鼠,雌性,各24只为研究对象,随机分为WT对照组、IL-17A-/-对照组、WT治疗组、IL-17A-/-治疗组,每组6只。腹腔注射相同基因背景来源的小鼠卵巢癌细胞系ID8细胞,建立腹腔种植瘤动物模型。经DDP或等量生理盐水给药4周和6周后,处死小鼠,打开腹腔观察并统计腹壁、大网膜、肠系膜及主要脏器表面瘤结节形成情况。采用免疫组化染色检测WT小鼠和IL-17A-/-小鼠对照组肿瘤组织中IL-17A、ABCG2、MDR1及Gli1表达情况,以探讨内源性IL-17A促进卵巢癌DDP耐药的分子机制。Westernblot检测各组小鼠卵巢癌种植瘤组织中ABCG2、MDR1及Gli1的表达情况。结果WT对照组腹腔内瘤结节数明显高于IL-17A-/-对照组,其治疗组腹腔内瘤结节数也高于IL-17A-/-治疗组(P<0.05);WT对照组小鼠腹腔肿瘤组织中ABCG2、MDR1、Gli1蛋白表达水平明显高于IL-17A-/-对照组,同样地,WT治疗组小鼠腹腔肿瘤组织中ABCG2、MDR1、Gli1蛋白表达水平也明显高于IL-17A-/-治疗组(P<0.05)。结论内源性IL-17A通过Gli1介导的Hh信号通路上调耐药相关蛋白ABCG2和MDR1的表达,进而促进卵巢癌腹腔种植瘤的DDP耐药。

胶质母细胞瘤FGFR3-TACC3融合基因介导丙酮酸激酶M2入核促进DNA损伤修复基础研究

目的探讨胶质母细胞瘤FGFR3-TACC3(F3-T3)融合基因介导丙酮酸激酶M2(PKM2)入核激活DNA损伤修复致替莫唑胺(TMZ)耐药的作用机制。方法慢病毒转染构建稳定表达F3-T3融合基因和空载体的胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251MG,构建稳定表达F3-T3融合基因的胶质母细胞瘤裸鼠模型,小动物活体成像系统观察荷瘤鼠肿瘤荧光信号强度;采用生物信息学分析基因芯片转录组数据分析F3-T3融合基因的生物学功能,并分析肿瘤基因组学图谱计划(TCGA)数据库中胶质瘤患者生存期与PKM2基因表达的关系;瞬时转染小干扰RNA(siRNA)敲低PKM2基因表达;CCK-8细胞增殖实验观察经梯度浓度替莫唑胺处理后、转染siRNA后、替莫唑胺联合PKM2抑制剂Compound 3k处理后U87MG和U251MG细胞增殖活性;提取核质蛋白并观察经替莫唑胺处理后总蛋白提取物、胞质提取物和胞核提取物PKM2蛋白表达情况;Western blotting法检测稳定表达F3-T3融合基因的U87MG和U251MG细胞PKM2蛋白相对表达量、磷酸化组蛋白H2AX(p-H2AX)相对表达量、siRNA敲低PKM2基因p-H2AX相对表达量。结果(1)CCK-8细胞增殖实验显示,经替莫唑胺640、320、160、80、40μmol/L处理后F3-T3转染组的U87MG细胞存活率均高于空载体转染组(P=0.000,0.000,0.000,0.004,0.010),经替莫唑胺640、320、160、80、40、20、5μmol/L处理后F3-T3转染组的U251MG细胞存活率亦均高于空载体转染组(P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.002,0.001,0.002);然而,经替莫唑胺640、320、160、80、40、20、10、5和2.50μmol/L处理后si-PKM2-1009转染组的U87MG细胞存活率均低于F3-T3转染组(P=0.000,0.000,0.000,0.012,0.006,0.030,0.000,0.007,0.025),经替莫唑胺640、320、160、80、40、20、5μmol/L处理后si-PKM2-1377转染组U251MG细胞存活率亦低于F3-T3转染组(P=0.000,0.000,0.002,0.000,0.002,0.048,0.042);经替莫唑胺640、320、160、80、40、20μmol/L处理后TMZ+Compound 3k组U87MG细胞存活率低于TMZ组(P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.001,0.002),经高浓度(640、320、160、80、40μmol/L)替莫唑胺处理后TMZ+Compound 3k组U251MG细胞存活率亦低于TMZ组(P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.003),而经低浓度(10、5、2.50μmol/L)替莫唑胺处理后TMZ+Compound 3k组U251MG细胞存活率高于TMZ组(P=0.000,0.000,0.006)。(2)胶质母细胞瘤动物模型显示,荷瘤鼠存在替莫唑胺耐药。(3)生物信息学分析,F3-T3融合蛋白的生物学功能显著富集于DNA修复通路(P=0.000)。TCGA数据库中胶质瘤患者PKM2基因高表达组生存率和总生存期均低于低表达组(P<0.05)。(4)Western blotting法显示,经替莫唑胺处理48 h再更换培养基后24、36和48 h,F3-T3转染组U87MG(P=0.000,0.000,0.004)和U251MG(P=0.000,0.007,0.005)细胞p-H2AX蛋白相对表达量均低于空载体转染组;经替莫唑胺处理后F3-T3转染组U87MG和U251MG细胞均可见明显的PKM2入核,而空载体转染组细胞均未见这一现象;si-PKM2-1009和si-PKM2-1377分别敲低U87MG(P=0.000,0.001,0.006)和U251MG(P=0.000,0.000,0.000)细胞PKM2基因表达的效果最显著。结论F3-T3融合基因可促进PKM2入核,激活DNA损伤修复相关通路,进而介导胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药,不同细胞株对替莫唑胺的耐药浓度不一致,PKM2抑制剂可逆转这种耐药。

毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术测定甲氨蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶

目的为观察甲氨蝶呤（MTX）对映体诱导肺癌A549细胞株耐药后叶酰聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthetase，FPGS）含量变化，建立一种用毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术（CEIA-LIF）测定F＇PGS的方法，以便为深入探讨肿瘤耐药机制提供新的实验手段。方法实验分别选用耐药浓度为25μmol／L的L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX肺癌A549耐药细胞株，以MTX敏感的细胞株作对照，培养获取上述3株细胞，并粗提取FPGS做CEIA-LIF和免疫印迹（WB）实验；用异硫氰酸荧光素（FITC）标记FPGS抗体，与提取的FPGS进行免疫反应；然后采用CEIA-LIF，根据不同分子量蛋白具有不同的迁移时间，分离检测标记蛋白，检测L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX作用耐药前后3株肺癌A549细胞株中FPGS表达含量；同时用WB作对照，以评价CEIA-LIF的特异性和FPGS定量的准确性。结果CEIA-LIF分离标记FPGs抗体与免疫复合物的分离时间分别为7.1、8．9min，分离度（R）=4．5，在10min内即完成蛋白的分离和检测。经WB鉴定3株细胞液氮冻融裂解后离心提取液中组分与FIGS抗体无非特异性条带出现。CEIA-LIF测定敏感细胞株的检测下限为0．68mg／山细胞；而其检测25μmol／LL-（＋）-MTX和25μmol／LD-（-）-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为对照组敏感细胞的46．59％和48．36％。结论本研究建立的CEIA-LIF检测FPGS法具有高效快速的特点，且具与WB类似的特异性；同时提高了检测的敏感度。L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX诱导耐药后细胞株中FPGS表达含量较敏感细胞株明显减少，证明MTX耐药细胞株FPGS表达含量受损。

实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGSmRNA的表达

目的建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGSmRNA表达的方法，研究MTX对映体[L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异，并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGSmRNA表达水平的变化。方法用SYBRGreenI为荧光染料，以β—actin作参照，建立检测FPGSmRNA的实时荧光定量PCR方法。根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价。并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGSmRNA的表达。结果建立的标准曲线ct值与模板浓度有良好的线性关系，FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0．9968和0．9987，斜率分别为-3．595和-3．740，批内CV为1．27％-2．95％，批间CV为3．82％；熔解曲线均呈单个特异峰，扩增效率相似（斜率为0．0217）；L．（＋）-MTX耐药细胞和D．（-）-MTX耐药细胞中FPGSmRNA相对含量分别为（3．51±0．66）和（0．16±0．01），A549亲本细胞（S）中FPGSmRNA相对含量为（1．00±0．31），差异有统计学意义（F=64．45，P〈0．01）；L-（＋）-MTX耐药细胞和D．（-）-MTX耐药细胞间FPGSmRNA相对含量差异有统计学意义（q=9．29，P〈0．01）。白血病患者应用MTX治疗耐药后，FPGSmRNA表达水平为（0．35±0．04），用药前为（1．00±0．44），差异有统计学意义（t=8．83，P〈0．01）。结论建立的实时荧光定量PCR检测FPGSmRNA的方法重复性好、特异度高，可用于FPGSmRNA含量分析。MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGSmRNA表达发生了变化，MTX2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用。

顺铂耐药卵巢上皮性癌细胞株及其裸鼠移植瘤模型的建立及耐药特性探讨

目的：建立顺铂耐药性稳定的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞株及其裸鼠移植瘤模型并探讨其耐药特性，为研究体内微环境耐药机制及逆转靶基因筛选奠定基础。方法采用体内外交叉诱导和连续体内诱导两种方法，以绿色荧光蛋白（GFP）标记的卵巢癌细胞株SKOV3/GFP分别建立两株顺铂耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/DDPⅠ（为耐药细胞的对照）和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和流式细胞仪检测细胞耐药指数，流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期比例，高效液相色谱仪检测细胞内顺铂积量；透射电镜观察移植瘤组织的超微结构，实时荧光定量PCR技术检测移植瘤组织中铂类耐药相关基因——PTEN、STAT5、XIAP、BRCA1和MDR1 mRNA的表达水平。结果成功构建顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDPⅠ和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。MTT比色法和流式细胞仪检测显示，SKOV3/DDPⅡ细胞的耐药指数分别为2.83±0.12和3.82±0.19，SKOV3/DDPⅠ细胞的耐药指数分别为2.20±0.16和3.40±0.20，两种检测方法分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）。流式细胞仪检测显示，29.7和39.6μmol/L顺铂处理36 h后， SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞的凋亡率[分别为（57.0±1.4）%、（74.4±2.3）%和（37.6±4.4）%、（50.5±3.4）%]均显著低于SKOV3/GFP细胞[（83.1±2.7）%和（87.4±4.0）%；P=0.024，P=0.001]，且SKOV3/DDPⅡ细胞的凋亡率明显低于SKOV3/DDPⅠ细胞（P=0.020）；SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞G2/M期比例与顺铂处理时间（为0、12、24、36和48 h）呈正相关（R=0.800，P=0.104；R=0.915，P=0.029）。高效液相色谱仪检测显示，以9.9、19.8、29.7和39.6μmol/L的顺铂分别处理12、24、36和48 h后，SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞内顺铂积量均显著低于SKOV3/GFP细胞（P〈0.05）。透射电镜观察，接种SKOV3/GFP细胞的裸鼠移植瘤组织中，在腹腔内注射顺铂（为4 mg/kg）5次后，大部分细胞器降解，细胞核膜不完整；而接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织中，在腹腔内注射顺铂8次后才出现细胞器降解。实时荧光定量PCR技术检测显示，腹腔内注射顺铂8次后，接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织中PTEN mRNA的表达水平明显低于接种SKOV3/GFP细胞者（P=0.002）；STAT5、XIAP和BRCA1 mRNA的表达水平明显高于接种SKOV3/GFP细胞者（P〈0.05）；而MDR1 mRNA几乎均无表达。结论本研究建立的顺铂耐药细胞株SKOV3/DDPⅡ具有稳定的耐药性。接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织过度表达BRCA1、XIAP、STAT5 mRNA，促进细胞DNA损伤修复、降低细胞凋亡、促进细胞增殖，而低表达PTEN mRNA则减弱了对细胞增殖的抑制作用，符合临床上铂类耐药细胞的耐药机制。