应用Methylight法检测胃癌病人p16基因的甲基化状态

目的探讨用Methylight法检测p16基因启动子区甲基化的可行性以及在肿瘤分子诊断中的应用价值。方法从45例原发性胃癌患者的石蜡包埋肿瘤组织中提取基因组DNA,通过焦亚硫酸钠修饰将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。通过115bp的Methylight法和经典的MSP法检测p16基因的甲基化状态。结果以甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)MSP法做为金标准,我们发现Methylight法检测p16基因甲基化的灵敏度、特异性和符合率分别为88.2%、92.9%和91.1%。结论 Methylight法是一种可靠、实用的检测p16甲基化的方法,可用于肿瘤的分子学诊断。

检测锯齿状腺瘤中CDX2基因甲基化率的两种qPCR方法比较

目的应用两种方法检测锯齿状腺瘤中CDX2基因甲基化状态,比较这两种检测方法的差异。方法采用Taqman探针qPCR(MethyLight)和SYBR Green qPCR方法检测129例锯齿状腺瘤(包括61例SSA/P、68例TSA)和42例正常结直肠黏膜组织中CDX2基因CpG岛甲基化状态。结果 MethyLight方法:SSA/P组织中CDX2基因甲基化率(75.41%,46/61)高于对照组(53.38%,22/42),两者差异显著(P<0.05)。TSA组织中CDX2基因甲基化率(80.88%,55/68)高于对照组(53.38%,22/42),两者差异显著(P<0.05)。SYBR Green qPCR方法:SSA/P、TSA组和对照组的组织中CDX2基因均呈高甲基化状态,SSA/P组织中CDX2基因甲基化率(81.97%,50/61)高于对照组(73.81%,31/42),两者比较差异不显著(P>0.05);TSA组织中CDX2基因甲基化率(86.76%,59/68)高于对照组(73.81%,31/42),两者比较差异不显著(P>0.05);结论 MethyLight消除了引物二聚体和非特异性扩增对试验结果的影响,提高了结果的特异性和准确性,被证实是进行异常DNA甲基化状态检测的可靠方法。

人先天性神经管畸形胎盘印迹基因甲基化状态的研究

目的:研究不同孕周神经管畸形(NTD)胎儿孕妇胎盘中印迹基因H19,PEG10和IGF2基因启动子区的甲基化状态,分析其与NTD的关系。方法:应用MethyLight方法实时定量检测不同孕周28例NTD患儿孕母胎盘和28例正常对照乳母胎盘中印迹基因H19,PEG10和IGF2启动子区的甲基化状态。结果:印迹基因H19,PEG10和IGF2启动子区在胎盘中普遍发生甲基化,而且在NTD患儿孕母胎盘中,H19,PEG10和IGF2中甲基化率略高于正常乳母胎盘组,但无统计学差异。将样品按照不同孕周分组后,IGF2基因启动子区甲基化水平在31～36周NTD胎儿乳母胎盘中显著高于正常胎儿乳母胎盘(P<0.05)。结论:印迹基因H19,PEG10和IGF2启动子区在所检测的NTD患儿孕妇的胎盘中总体甲基化水平与正常胎儿乳母胎盘无差异。但在妊娠31～36周时,NTD胎儿乳母胎盘中IGF2启动子甲基化水平显著高于正常胎儿乳母胎盘,提示印迹基因IGF2的甲基化状态可能与NTD的发生有关。

基于液态活检的4种甲基化检测方法的比较及临床应用价值评价

目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方法的检测限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)及稳定性方面进行比较,其中稳定性用变异系数(coefficient of variation,CV)来评估。结果 SFRP2基因在Methy Light、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOD分别为1.2500ng/孔、0.0625ng/孔、0.0625ng/孔、1.2500ng/孔,在LOD方面,ddPCR和核酸质谱的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOQ分别为0.800%、0.032%、4.000%、0.032%,在LOQ方面,ddPCR和靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的变异系数分别为2.72%、0.68%、0.73%、0.15%,在稳定性方面,靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现最好。结论 ddPCR的甲基化检测在检测限、定量限稳定性和经济性方面具有优越性,能够稳定地检测出肿瘤细胞的痕量游离DNA,在液态活检中具有广泛应用前景。

甲基化荧光PCR检测母血中游离胎儿maspin基因的研究

目的:探讨Taqman探针与甲基化特异性PCR(MSP)技术结合测定孕妇血浆中甲基化maspin(M-maspin)基因和非甲基化maspin(U-maspin)基因的可行性,并分析微量U-maspin的临床意义。方法:选择正常早、中、晚期妊娠妇女各30例为研究对象,健康未妊娠女性30例为对照,提取其血浆游离DNA。通过含目的基因质粒标准品绘制标准曲线,并应用甲基化荧光PCR方法检测各组血浆标本亚硫酸氢盐修饰后M-maspin基因和U-maspin基因的含量,分别代表母源性游离DNA和胎源性游离DNA水平。结果:除3例早期妊娠孕妇外,其余孕妇血浆中均检出了U-maspin基因,平均浓度在早期妊娠组为57拷贝/ml,中期妊娠组为121拷贝/ml,晚期妊娠组为561拷贝/ml;占母源性M-maspin基因的比例分别为1.88%、3.21%、9.58%。结论:母血中U-maspin基因具有游离胎儿DNA的动力学特点,可能成为一种通用胎儿标记物,应用甲基化荧光PCR技术检测孕妇血浆中微量U-maspin基因方法准确、可行。

基因LSM2甲基化在上皮性卵巢癌发病中的作用研究

目的:检测上皮性卵巢癌患者肿瘤组织DNA中基因LSM2启动子区CpG岛(CpG island,CGI)的甲基化状态,探讨其在上皮性卵巢癌发病机制中的作用。方法:选取50例上皮性卵巢癌患者和25例卵巢良性病变患者作为实验组和对照组,提取肿瘤组织DNA,用Taqman实时荧光定量PCR(MethyLight)方法检测基因LSM2启动子区CGI在肿瘤组织DNA中的甲基化状态。结果:上皮性卵巢癌和卵巢良性病变患者肿瘤组织DNA中,基因LSM2启动子区CGI的甲基化率分别为10%(5/50)和32%(8/25),与卵巢良性病变患者相比,上皮性卵巢癌患者基因LSM2启动子区CGI的甲基化程度降低,差异具有统计学意义(χ2=5.318,P<0.05)。结论:基因LSM2启动子区CGI在上皮性卵巢癌患者肿瘤组织中呈现低甲基化改变,有可能成为新的上皮性卵巢癌特异性的低甲基化肿瘤标志物。