人GFP-Sp1基因真核表达载体的构建及其对细胞周期调控作用研究

背景乳腺癌目前已经成为女性发病率最高的恶性肿瘤,因此寻找有效治疗靶点进而控制肿瘤发生发展至关重要。目的构建带绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-C1的Sp1真核表达载体,在获得pEGFP-Sp1融合表达蛋白后,对其功能进行验证。方法以人乳腺文库为模版,采用PCR技术扩增出Sp1的CDS区编码序列技术,将其插入到pEGFP-C1载体中,经酶切和测序验证成功后,转染至人胚肾293T细胞,蛋白质印迹法检测该融合蛋白的表达情况;分别转染pEGFP-C1、pEGFPSp1到人乳腺癌细胞ZR75-1细胞中,通过荧光显微镜观察Sp1蛋白在细胞中定位情况,通过逆转录PCR检测细胞周期基因转录水平。结果经双酶切及测序鉴定证明pEGFP-Sp1质粒构建成功,蛋白印迹检测蛋白表达成功;荧光显微镜结果显示Sp1主要定位于人乳腺癌细胞ZR75-1细胞的细胞核中,逆转录PCR结果显示过表达Sp1可改变细胞周期相关基因转录水平。结论通过构建真核表达载体pEGFP-Sp1,可确定Sp1蛋白在人乳腺癌细胞ZR75-1细胞中表达,且主要表达于细胞核中。同时Sp1可下调Cyclin D2与CDK6 mRNA水平,上调Cyclin G2和p18 mRNA水平。综上所述,我们的结果表明Sp1在细胞周期通路中发挥重要的功能,这为进一步深入研究Sp1转录因子的功能提供基础。