二尖梅奇酵母的致病性研究及敏感药物筛选

为探明中华绒螯蟹“牛奶病”病原——二尖梅奇酵母对中华绒螯蟹的致病性,并筛选病原敏感药物用于指导生产,笔者采用自发病蟹处分离的二尖梅奇酵母,通过人工回感健康中华绒螯蟹[平均体质量(6.8±0.7)g]确定其半致死密度,研究温度对其感染的影响,探索二尖梅奇酵母的致病力,并采用牛津杯法测试二尖梅奇酵母对多种药物的敏感性及敏感药物的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度。结果显示:二尖梅奇酵母在水温15℃、感染14 d后,对蟹种的半致死密度为1.05×10^(5)cfu/mL;在10~30℃,中华绒螯蟹发病死亡率与温度呈正相关;在实验室养殖条件下(22℃),注射密度为2.1×10^(3)cfu/mL的病原酵母21 d后可致90%的中华绒螯蟹死亡。葡萄糖酸氯已定醇溶液、制霉菌素、苯扎溴铵、大蒜粗提物等对二尖梅奇酵母有一定的杀灭作用;葡萄糖酸氯已定醇溶液、制霉菌素、苯扎溴铵对二尖梅奇酵母的最小抑菌质量浓度分别为10、10、5 mg/L,最小杀菌质量浓度分别为20、100、10 mg/L;大蒜粗提物对二尖梅奇酵母也具有较好的抑制及杀灭效果,稀释32倍仍可杀灭病原酵母。本研究结果可为中华绒螯蟹“牛奶病”的科学防控提供参考和依据。

盘锦地区中华绒螯蟹养殖及越冬期间的“牛奶病”发病特点调查

近几年辽宁盘锦地区河蟹“牛奶病”暴发,给养殖户造成较大的经济损失。为了调查“牛奶病”的发病特点及规律,2022年7~9月份对盘锦地区的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)稻田养殖过程进行了“牛奶病”的监测与调查。2022年12月及2023年2月对不同扣蟹越冬暂养密度、不同越冬模式的扣蟹“牛奶病”发病情况进行了调查。结果显示,在稻田养殖阶段9月份为主要的发病时间,且成蟹养殖阶段的发病率高于扣蟹养殖阶段,扣蟹越冬暂养期间暂养密度越大,“牛奶病”患病率越高。越冬前挑选雌雄的过程会增加“牛奶病”患病率。该研究为中华绒螯蟹养殖及越冬暂养期间的“牛奶病”预防和控制提供数据支持。

脊尾白虾“僵尸病”的初探

为确定2018年冬季以来江苏省沿海地区养殖脊尾白虾患“僵尸病”的病原及流行病学特点,实验采用LB培养基和PDA培养基从病虾血淋巴中分离得到直径为1~3 mm、边缘整齐、米黄色隆起菌落;人工回感实验结果显示,回感后的脊尾白虾表现出与自然患病脊尾白虾相同的症状,并在回感脊尾白虾体内也分离出了相同的菌株,符合科赫氏法则。对该菌株进行形态观察结合18S r RNA序列对比及系统发育分析,发现分离菌株MQ2101具有酵母的典型形态,且与二尖梅奇酵母相似度达99.82%,结果表明菌株MQ2101为二尖梅奇酵母。致病性结果初步分析显示,MQ2101对脊尾白虾的半致死浓度(LD_(50))为1.39×10^(7)CFU/尾。病理学观察发现,患病脊尾白虾鳃、肌肉和肝胰腺均发生不同程度的病变,其中肝胰腺病变最为严重,肝小管呈现空泡化,管腔体积变大;在鳃和肝胰腺组织中均存在大量定殖的菌体。流行病学调查结果显示,每年2—5月发病迅速,发病率为5%~30%,死亡率为3%~10%。本研究确定了二尖梅奇酵母为江苏沿海地区脊尾白虾“僵尸病”的病原,其对脊尾白虾具有较强致病性,主要侵染组织为肝胰腺和鳃。以上研究结果为脊尾白虾“僵尸病”的防控提供了相关科学依据。

天津地区中华绒螯蟹及养殖环境中二尖梅奇酵母流行情况调查

为探究近年天津地区中华绒螯蟹(河蟹)“牛奶病”病原二尖梅奇酵母的感染情况及传播特点,本研究于2020年~2022年间,从天津地区稻蟹综合种养殖企业和育苗场采集各生长阶段河蟹样品(包括溞状幼体、大眼幼体、种蟹等)236批共8163只,环境样品51批共116份(包括养殖水体、底泥、稻田野杂鱼虾等)。将处理过的上述样品涂布孟加拉红固体平板,28℃培养48 h后观察菌落形态。采用PCR检测上述样品及疑似菌落中的二尖梅奇酵母并测序比对。结果显示,部分样品在固体平板上长出乳白色、边缘光滑、不透明的圆形菌落,镜检观察可见菌体长约3μm~7μm,呈大量多边出芽生殖的圆形或卵圆形。PCR结果显示部分样品出现339 bp的目的条带,测序后于NCBI数据库中比对结果显示,测序片段与二尖梅奇酵母相应基因序列高度一致。统计结果显示,河蟹样品总阳性率14.71%(1201/8163)、批次阳性率34.32%(81/236),养殖环境样品总阳性率12.07%(14/116)、批次阳性率13.73%(7/51)。根据PCR检测结果按月份统计2020年~2022年间河蟹二尖梅奇酵母的阳性率,分析该病原感染的季节流行规律;在该病原流行季节,按年份统计该病原的阳性率以分析该病原的流行趋势。对河蟹养殖环境经PCR检测该病原,并结合不同生长阶段河蟹及其环境样品的PCR检测结果,分析二尖梅奇酵母的传播途径,并分析该病原感染对河蟹养殖经济效益的影响。结果显示:3、4、5、6月份养殖河蟹的个体阳性率分别为26.22%(392/1495)、52.7%(293/556)、58.37%(408/699)和10.24%(43/420),批次阳性率分别为55.56%(25/45)、80.95%(17/21)、83.33%(25/30)和26.32%(5/19),其中4、5月份个体阳性率和批次阳性率均显著高于其他月份(P<0.05),7月~11月未检到该病原;对2020年~2022年每年3月~6月该病原感染河蟹的统计结果显示,2020年、2021年、2022年越冬后河蟹个体阳性率分别为37.17%(139/374)、43.69%(814/1863)、25.19%(235/933),2022年个体阳性率较2021年显著降低(P<0.05);越冬后二尖梅奇酵母感染河蟹的批次阳性率较高,2020年、2021年、2022年批次阳性率分别为86.67%(13/15)、71.43%(45/66)、44.12%(15/34),呈逐年下降趋势。河蟹养殖环境的PCR检测结果显示,当年春季暴发“牛奶病”的暂养池水体和底泥中检出大量二尖梅奇酵母,而上一年发病暂养池的上述样品及稻田野杂鱼虾中均未检到该病原。不同生长阶段河蟹及其环境样品检测结果显示,二尖梅奇酵母在育苗期间种蟹中的样品阳性率达36.11%(65/180),批次阳性率达90%(9/10),但在溞状幼体、大眼幼体中均未检到该病原。感染二尖梅奇酵母的扣蟹(感染率在26.92%以上)虽未发生“牛奶病”,但当年成蟹同比缩小30%~50%,产量降低30%以上。上述结果表明,天津地区二尖梅奇酵母感染河蟹时期为每年3月~6月,其中4月~5月为感染高峰期,且感染率呈逐年下降趋势;水平传播是二尖梅奇酵母的主要传播方式,未发现垂直传播途径;感染该病原后严重影响河蟹养殖的经济效益。本研究为了解中华绒螯蟹“牛奶病”病原的流行规律和传播途径,并为制定该病的有效防控措施提供了参考依据。

辽宁地区中华绒螯蟹“牛奶病”的病原分离与鉴定

为探究中华绒螯蟹Eriocheir sinensis“牛奶病”的病原,从病蟹(体质量25~35 g)体内分离到一株优势菌,记为2EJM001,该菌可生长在YPD和NA培养基上,形成1~3 mm白色不透明隆起的圆形菌落,并对菌株进行了形态观察、生理生化试验、药敏试验及18S rDNA分子鉴定。结果表明:该菌株可以使明胶液化,可发酵葡萄糖,不可发酵乳糖、棉子糖、密二糖、半乳糖、麦芽糖和水解淀粉,硝酸盐还原为阴性;对酮康唑、氟康唑、益康唑等药物高度敏感;18S rDNA分子序列与二尖梅奇酵母Metschnikowia bicuspidata的一致性为99.53%且二者自然聚为一支,亲缘关系较近,将其鉴定为二尖梅奇酵母;组织病理检查发现,病蟹肌纤维结构松散、横纹消失,部分区域溶解液化;人工感染试验发现,该菌株对健康中华绒螯蟹具有致病性,并出现与自然病蟹相同的症状。研究表明,二尖梅奇酵母是辽宁地区中华绒螯蟹“牛奶病”的病原。

天津地区1例中华绒螯蟹“牛奶病”病原分离、鉴定及其病理特征分析

为探究天津地区中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)“牛奶病”案例的病原,本研究采用流行病学调查、病原分离、18S rDNA基因序列分析、人工感染试验和免疫组织化学分析来明确病原种类及其组织分布特征、时序变化特征。结果表明:自然发病蟹的主要临床症状包括对外界刺激反应慢或基本不反应,头胸甲腔内蓄积乳白色血淋巴,头胸部及步足基部关节膜连接处肌组织呈不透明乳白色,肝胰腺呈白色半流体糜烂状。基于18S rDNA基因序列的系统发育分析表明,真菌分离株P13被鉴定为二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)。人工感染试验结果表明,真菌分离株P13能够在实验室条件下感染健康中华绒螯蟹[累积死亡率为(55.0±2.4)%],导致实验蟹呈现与自然发病蟹相似的临床症状,且能从实验蟹中再分离出二尖梅奇酵母。免疫组织化学分析结果表明,真菌分离株P13能够侵染中华绒螯蟹肝胰腺、后肠、鳃、心脏和肌组织,引起靶组织不同程度的病理损伤并呈现时序变化特征。综上所述,二尖梅奇酵母是天津地区中华绒螯蟹“牛奶病”的病原,本文也初步揭示了该病原的主要靶组织及组织分布特征和时序变化特征,为深入研究二尖梅奇酵母的致病机制提供了理论依据,为中华绒螯蟹“牛奶病”的防控提供了技术支撑。

江苏沿海地区养殖脊尾白虾“僵尸病”的防控药物筛选研究

对近年来江苏沿海地区脊尾白虾养殖中常爆发的“僵尸病”进行了初步的防控药物筛选,试验采用纸片扩散法(K-B法)测定了二尖梅奇酵母MQ2101对18种抗菌类药物的敏感性,并采用微量稀释法测定了8种优选药物及7种常见消杀制剂对二尖梅奇酵母MQ2101的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示,在优选的8种抗菌药物中克霉唑、益康唑、制霉菌素、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、酮康唑对二尖梅奇酵母MQ2101具有较好的抑制效果,MIC均为0.125μg·mL^(-1);伊曲康唑对二尖梅奇酵母的杀灭效果最好,MBC为0.25μg·mL^(-1);在常见消杀制剂中高锰酸钾、甲醛对二尖梅奇酵母MQ2101的抑制效果最好,MIC为50μg·mL^(-1),亚甲基蓝、甲醛对二尖梅奇酵母MQ2101的杀灭效果最好,MBC均为200μg·mL^(-1)。最后,本研究结合养殖过程中的实际情况提出了脊尾白虾“僵尸病”的防控建议。