铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础。方法从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定。结果获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1(1.5 kb)基因,序列分析结果与PAO1/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA(1.2 kb)片段相符。结论含mexA(1.2 kb)基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础。

铜绿假单胞菌mexA基因的克隆及其序列分析

目的克隆铜绿假单胞菌临床菌株mexA基因并进行序列分析。方法从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA基因与PUC18克隆载体连接,对重组质粒进行测序验证。结果成功地克隆了mexA基因,重组质粒(PUC/mexA)经测序与Genebank检索的mexA基因序列进行对比证实为99.9%同源。结论所构建的铜绿假单胞菌临床菌株mexA基因克隆适于进一步的克隆表达。

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化。方法从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达。结果已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同。SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在。结论获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达。融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础。