siRNA干扰铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM外排泵mexB基因表达的研究

目的探讨RNA干扰技术对铜绿假单胞菌MexA—MexB-OprM外排泵mexB基因表达及有关功能的影响。方法设计并合成4条小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）（siRNAl、siRNA2、siRNA3和siRNA4）序列，构建干扰RNA（short hair pin RNA，shRNA）表达载体，将带有siRNA质粒电转入PAOI和临床耐药株PA03。应用E-test方法检测PA01和PA03抗生素MIC的变化。用半定量RT—PCR和定量PCR方法检测mexB的表达变化。结果经酶切鉴定siRNA表达载体构建成功，并明显提高PAO和临床耐药株PA03对抗生素的敏感性。RT-PCR结果显示干扰后的PA01和临床耐药株PA03mexB基因表达明显下降（P〈0．05）。结论siRNA成功干扰MexA－MexB－OprM外排泉mexB基因的表达，提高铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性，为临床上治疗铜绿假单胞菌感染，降低其耐药性提供了新的思路。

河曲马源大肠杆菌耐药相关基因检测及外排泵抑制剂对其生物被膜的影响

[目的]了解河曲马源大肠杆菌的耐药情况,为兽医临床合理使用抗菌药物提供基础理论指导。[方法]采用细菌形态学、革兰染色镜检、16S rDNA序列分析等方法进行细菌分离鉴定。采用微量肉汤稀释法和PCR扩增方法对分离鉴定的大肠杆菌进行抗菌药物敏感性试验及耐药基因、整合酶基因、外排泵基因携带情况检测。同时,采用改良结晶紫半定量方法进行生物被膜形成能力测定。利用棋盘法测定13种外排泵抑制剂与多西环素联用对生物被膜的清除作用。[结果]分离株在伊红-美蓝琼脂培养基上为具有绿色金属光泽的紫黑色菌落,在大肠杆菌/大肠菌群显色培养基上为蓝色菌落,革兰染色镜检可见粉红色短杆状细菌。经16S rDNA测序比对与大肠杆菌高度相似的分离株为64株。64株大肠杆菌分离株对酰氨醇类、磺胺类及利福霉素类药物耐药率相对较高并出现多重耐药菌株,其中20.31%(13/64)表现出对5类抗菌药物耐药;检测到21个耐药基因、1个整合酶基因及6个外排泵基因为阳性;整合酶基因intl 1检出率为89.06%。生物被膜形成能力为强、中、弱及无成膜能力的大肠杆菌分别为8(12.50%)、34(53.13%)、20(31.25%)和2(3.12%)株。外排泵抑制剂与多西环素联合能增强对生物被膜的清除能力。[结论]河曲马源大肠杆菌耐药较为严重,应进一步加强青海省河南蒙古族自治县赛马的用药监管力度,减少或避免多重耐药菌株的出现及耐药性广泛传播。

细菌外排泵功能及抑制机制的研究进展

近年来,由于抗生素在临床上的不规范使用,细菌耐药率呈快速增长趋势,显著增加临床的抗感染治疗难度。对于耐药菌而言,外排蛋白基因占所有转运蛋白基因的6%~18%。因此,由外排基因编码的外排泵是细菌产生多重耐药的重要机制之一。最新研究结果表明,外排泵抑制剂是通过抑制外排泵研发针对性抗生素的新治疗靶点,因此,为解决细菌多重耐药性问题,研发外排泵抑制剂势在必行。鉴于此,本研究对细菌外排泵的功能和抑制机制进行综述,以期为临床合理用药及医院感染防控提供帮助与指导。

阿米卡星诱导对大肠埃希氏菌耐药性及生物被膜和外排泵活性的影响

为研究亚抑菌浓度阿米卡星诱导对大肠埃希氏菌敏感菌株耐药性、生物被膜形成能力及外排泵活性的影响,采用微量肉汤稀释法测定阿米卡星对6株菌株的最小抑菌浓度(MIC),并以0.5 MIC作为初始诱导浓度进行诱导,每隔5 d重新测定阿米卡星MIC,并调整诱导浓度,共计30 d,最后将诱导第30天菌株进行无药物压力稳定培养5 d,保存各诱导菌株及无药传代菌株共计210株,测定各诱导菌株药物敏感性、生物被膜形成能力及部分菌株外排泵活性变化。结果发现,随着诱导天数的增加,阿米卡星对6株分离菌株MIC逐渐升高,诱导菌株耐药性不断增强,其对诱导第30天菌株的MIC值为诱导前的8~32倍;经过5 d无药培养后,MIC测定结果与第30天基本保持一致;诱导后的菌株中,强成膜能力菌株占总数的5%,中成膜能力菌株为56.7%;以每5 d的生物被膜形成量平均值与原菌相比,结果发现,所有诱导菌株生物被膜形成量均显著增加(P<0.01),表明亚抑菌浓度阿米卡星诱导可促进大肠埃希氏菌生物被膜的形成;无药稳定培养5 d的菌株与诱导第30天菌株相比,生物被膜形成能力基本保持不变。荧光探针测定外排泵结果显示,诱导菌株外排泵活性显著受到抑制。以上研究结果表明,阿米卡星诱导促进菌株生物被膜的形成,抑制外排泵活性,使菌株的耐药性增强,研究结果可为氨基糖苷类药物用药提供理论依据。

嗜水气单胞菌RND外排泵中药抑制剂的筛选

随着抗生素的滥用,抗菌药物耐药性(Antimicrobial resistance,AMR)已经成为重大公共卫生问题。研究表明革兰氏阴性菌中普遍存在的RND (Resistance Nodulation Division)外排泵在细菌多重耐药机制中扮演了关键角色。RND外排泵抑制剂(efflux pump inhibitors, EPIs)可以将大大降低细菌的耐药性。化学药物类抑制剂虽然抑制效果好,但副作用大,限制了其在临床和水产养殖业上的应用。已证实多种植物及其成分有抑制细菌产生耐药性和消除耐药性等作用,因此中草药成为筛选外排泵抑制剂的巨大宝库。本研究选用了利血平、N-甲基吡咯烷酮、板蓝根、黄芪、连翘、黄连等中药作为抑制嗜水气单胞菌耐药性的候选药物,结果表明利血平的抑菌效果和抑制耐药性的效果最显著,黄连次之。联合药物作用实验结果显示,利血平和OXY在2.5 μg/mL和10 μg/mL的作用下抑菌效果显著。Western blotting结果显示,RND外排泵中的AcrA蛋白的表达量随着利血平浓度的上升而下降,推测说明利血平可能是通过抑制AcrA蛋白的表达来抑制外排泵的外排效率,从而降低嗜水气单胞菌的耐药性。本研究为中药抗生素联合制剂在临床和水产养殖上的应用提供分子基础,为解决细菌耐药性提供理论依据和参考。

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生物膜形成与外排泵基因AdeABC表达的相关性研究

目的 研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成,以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法 将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CSAB)组,采用结晶紫染色法检测两组生物膜形成能力;通过微量肉汤稀释法分别测定两组对亚胺培南的MIC、MBIC值,并计算MBIC/MIC的比值进一步比较分析生物膜菌和浮游菌的耐药性;同时提取CRAB组浮游态和生物膜态的RNA,通过RT-qPCR检测外排泵基因AdeABC相对表达量。结果 35株标本的生物膜阳性率为91.43%,其中CRAB组生物膜的阳性检出率为92%,生物膜阴性、弱阳性、阳性和强阳性分别占8%、48%、36%和8%。MBIC/MIC比值显示,形成生物膜后,鲍曼不动杆菌的耐药能力呈现不同程度的增加,CSAB组的耐药增加幅度以2倍的菌株最多;CRAB组的增加幅度以4倍的菌株最多。同时CRAB组RT-qPCR结果显示,生物膜较浮游态相比,外排泵基因adeA和adeB的相对表达量明显增高(P<0.01),外排泵基因adeC相对表达量则无差异(P>0.05)。结论 鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药与生物膜密切相关,且生物膜态的鲍曼不动杆菌较浮游态可促进外排泵基因AdeABC的表达从而增强碳青霉烯类抗生素的耐药性。

临床分离株鲍曼不动杆菌耐药性与AdeABC及AdeIJK外排泵基因表达相关性研究

目的 分析鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, A.baumannii)感染病人分离的A.baumannii外排泵相关基因的携带情况,探讨其与抗生素的耐药之间的关联,为医院感染防控及临床合理用药提供实验依据。方法 选择2022年1月—2023年9月本院收治的感染A.baumannii的住院患者作为研究对象,共分离A.baumannii菌株55株,采用real-time PCR技术对A.baumannii外排泵adeA、adeB、adeC、adeI、adeJ、adeK等基因表达水平进行检测;MIC法和K-B法检测各菌株的抗生素敏感性。按美国CLSI2023年版要求对各菌株进行抗生素敏感性判断。结果 与敏感组A.baumannii比较,不敏感组A.baumannii的adeA、adeB、adeC、adeJ基因表达较高,差异具有统计学意义(P<0.05);相对于敏感组,不敏感组adeB表达水平表达上调约3~30倍,差异具有统计学意义(P<0.05),adeJ表达水平表达上调约11~876倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 adeB和adeJ在本机构临床株鲍曼不动杆菌抗生素耐药中发挥一定的作用,但多种耐药机制可能参与调节鲍曼不动杆菌耐药,针对AdeABC和AdeIJK外排泵的深层次耐药机制以及其他耐药因素的分析仍需进一步探讨。

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌外排泵AdeABC的研究

目的从外排泵表型和基因型两个方面探讨外排泵系统在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制中所起的作用。方法外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)对138株鲍曼不动杆菌的外排泵进行表型检测;荧光定量PCR测定外排泵adeABC在51株鲍曼不动杆菌中的表达情况。结果泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)和美罗培南协同实验的结果显示:138株临床分离菌中,CCCP抑制实验共筛选出泵阳性菌株28株,其中对美罗培南耐药的39株菌中有15株即38.4%的菌株为泵阳性株,对美罗培南敏感的99株菌中有13株即13.1%的菌株为泵阳性株。经卡方检验统计学分析,差异有显著意义(χ2=12.477b,P=0.01);荧光定量PCR检测菌株的adeB和16s rRNA后,根据检测结果计算出adeB表达量差异。经t检验统计学分析结果显示碳青霉烯类抗生素敏感组的adeB的表达量是0.899±1.172,耐药组的表达量是21.101±21.443,敏感组的表达量显著低于耐药组的表达量,差异有统计学意义(t=4.403,P=0.000)。结论主动外排泵机制在临床分离的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中起作用。adeB基因或者adeABC外排泵机制可能在临床菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中起作用。

鲍曼不动杆菌adeB基因检测及外排泵抑制剂逆转亚胺培南耐药性的研究

目的研究多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵adeB基因表达量与亚胺培南耐药性的关系,探讨外排泵抑制剂对亚胺培南敏感性的影响,为外排泵及外排泵抑制剂在鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药性中的作用提供理论依据。方法筛选临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌79株,采用PCR法检测adeB基因表达情况,RT-PCR方法对adeB基因进行转录水平测定,并比较亚胺培南敏感及耐药组基因转录表达量有无差异;采用微量肉汤稀释法检测加入外排泵抑制剂PAβN、奥美拉唑前后adeB阳性及阴性组多重耐药菌对亚胺培南MIC值的变化。结果 79株多重耐药鲍曼不动杆菌中,adeB基因在亚胺培南敏感组及耐药组表达量存在差异。PAβN对adeB阳性组亚胺培南耐药性降低有统计学意义,对adeB阴性组无明显影响;奥美拉唑对adeB阳性组及阴性组亚胺培南耐药性降低均无统计学意义。结论鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药性与adeB基因高表达有关。PAβN降低adeB阳性组多重耐药鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药性,提高亚胺培南敏感性,对adeB阴性组无明显影响;奥美拉唑对亚胺培南耐药性无明显影响。

阿奇霉素对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵及耐药性的影响

目的探讨阿奇霉素对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的影响,为指导临床合理选择抗生素提供依据。方法排泵抑制剂(苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺PAβN)干预铜绿假单胞菌后,采用微量肉汤稀释法测定常见药物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值的变化,筛选主动外排表型阳性菌株。PCR扩增主动外排表型阳性菌株oprM、mexB和mexR;real-time PCR检测主动外排表型阳性菌株mexB的mRNA水平;对主动外排表型阳性菌株进行mexR基因测序分析。在阿奇霉素作用下,观察铜绿假单胞菌的mexB基因表达及对头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星和美罗培南的MIC值变化。结果从20个临床多重耐药的铜绿假单胞菌菌株中筛选出8株主动外排表型阳性菌。检测表明这8株菌oprM、mexB和mexR均呈阳性,mexB的mRNA水平均较PAO1显著增高。对8株MexAB-OprM高表达菌mexR基因进行测序,发现菌株PAO03的mexR基因存在突变。阿奇霉素可显著降低mexR基因未突变MexAB-OprM高表达菌株的mexB基因的表达和对头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星和美罗培南的MIC值,而对菌株PAO03和nalB突变株(mexR基因突变MexAB-OprM高表达菌株)无显著影响。结论阿奇霉素可抑制铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的表达,提高铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性。

细菌外排泵抑制剂

细菌外排泵与细菌耐药有关,为解决细菌耐药性问题,近年来外排泵抑制剂的研究受到关注。细菌外排泵抑制剂在结构上有差异,其共同特点是能抑制细菌对药物的外排从而恢复耐药菌对抗菌药物的敏感性。本文综述了近年来细菌外排泵NorA、Mex、Tet(B)和AcrAB-TolC抑制剂的研究进展情况。所发现的外排泵抑制剂在结构上有差异,其共同特点是能抑制细菌对药物的外排从而恢复耐药菌对抗菌药物的敏感性。植物是细菌外排泵抑制剂的来源之一,开发中草药资源对解决耐药菌感染问题具有实际意义。

RND家族外排泵及其与微生物群体感应系统的相互关系

抗生素耐药性一直是细菌病害防治的难题,药物外排泵过量表达是细菌耐药性形成的重要机制之一。在革兰氏阴性细菌中,RND(Resistance-nodulation-cell division)家族外排泵在耐药性中发挥着重要作用,近年来的研究表明,依赖于小分子信号物质进行调控的群体感应系统与RND外排泵家族之间存在紧密的相互作用关系。本文在介绍RND家族外排泵的结构、转运机理和群体感应系统的类型及调控方式的基础上,剖析了群体感应系统对RND外排泵的调控机理以及RND外排泵对群体感应系统信号分子转运的影响。深入研究RND家族外排泵与群体感应系统之间的相互依赖、相互制约关系有利于阐明RND家族外排泵的调控机理,并有可能为克服微生物耐药性问题提供新的思路。

泵抑制剂对嗜麦芽寡养单胞菌氟喹诺酮主动外排表型特征的影响

目的:探讨主动外排泵在嗜麦芽寡养单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药中的作用。方法:用泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)和利血平对5种氟喹诺酮类药物抗菌活性进行干预。采用琼脂二倍稀释法检测泵抑制剂存在时,嗜麦芽寡养单胞菌对莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星敏感性的变化。结果:主动外排泵不仅存在于耐药菌株,而且也存在于敏感菌株,但对耐药菌株影响更大。与泵阴性组比较,泵阳性组敏感率降低在左氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星组有统计学差异;耐药率增加在洛美沙星、环丙沙星组有统计学差异。结论:主动外排泵抑制剂CCCP和利血平可增强氟喹诺酮类药物对嗜麦芽寡养单胞菌的抗菌活性,对其耐药表型有影响。主动外排机制是嗜麦芽寡养单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药的原因之一。

微生物药物外排泵及其抑制剂研究

细菌自身的不断进化及抗生素的不合理使用导致了耐药性细菌的出现和蔓延,微生物的主动外排是导致细菌产生多重耐药的重要原因。微生物外排泵的研究是目前的热点之一,也被认为是开发新抗生素的理想靶标。本文从基因组和比较基因组水平对外排泵的类型、作用机制、表达调控及研究方法等方面概述,并结合正在开展的分枝杆菌的药物外排泵进行了比较基因组分析。这些工作有利于开发新的抗生素或抗生素增效剂。

全耐药铜绿假单胞菌中多药外排泵mRNA表达的定量RT-PCR检测

目的分析4种重要的药物外排泵系统在临床分离的全耐药铜绿假单胞菌与全敏感铜绿假单胞菌中表达的差异。方法用SYBR G reenⅠ实时定量RT-PCR方法检测临床分离鉴定的全耐药和全敏感铜绿假单胞菌中4种外排泵M exAB-OprM、M exCD-OprJ、M exEF-OprN、M exXY-OprM的mRNA。结果全耐药菌株较全敏感菌株多药外排泵M exAB、M exXY、M exCD、M ex-EF的mRNA表达明显增高(P<0.01)。以敏感菌株拷贝平均数×4判定明显高表达,则全耐药菌M exAB高表达率为18.9%;M exXY高表达率为13.5%;M exCD高表达率为56.8%;M exEF高表达率为35.1%。37株全耐药菌有1种外排泵高表达的8株;2种外排泵高表达的10株;3种外排泵高表达的4株;4种外排泵同时高表达的2株,4种外排泵表达均未增高的有13株。结论药物外排泵系统在临床全耐药铜绿假单胞菌耐药机制中起着重要作用,研究结果提示可能还存在其他耐药机制或存在外排泵功能与其表达量存在差异的情况。

22株多重耐药鲍曼不动杆菌临床株的外排泵AdeABC和AdeIJK的表达研究

目的研究鲍曼不动杆菌2个多重药物外排泵AdeABC和AdeIJK在临床株中的表达及与耐药的关系。方法微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌临床株对9种抗菌药物的敏感性,分别提取临床菌株的DNA和RNA进行adeB、adeJ的PCR及RT-PCR扩增,用凝胶扫描半定量分析外排泵的表达情况。结果22株多重耐药的鲍曼不动杆菌临床株在应用CCCP后,其中3株(13.64%)对头孢他啶的MIC值降至原值的1/4,6株(27.28%)对氧氟沙星的MIC值降至原值的1/4或1/4以下,12株(54.54%)对氯霉素的MIC值降至原值的1/4或1/4以下,22株(100%)对庆大霉素的MIC值降至原值的1/4以下。22株多重耐药临床株和4株敏感株进行基因adeB、adeJ的PCR扩增,均可见预期扩增产物。RT-PCR结果10株多重耐药株为adeB相对表达水平(灰度)1.211～9.169,平均3.897,4株敏感株未检测到adeB的表达。10株多重耐药株为adeJ相对表达水平(灰度)0.956～4.519,平均1.75,4株敏感株为0.356～0.576,平均0.447。结论鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC的表达、AdeIJK的高表达可能与耐药性有关。

志贺菌外排泵基因emrE的克隆表达及进化分析

目的研究志贺菌外排泵基因emrE的耐药功能及其进化。方法以志贺菌临床多重耐药株H24基因组为模板,扩增出含emrE基因的1126bp DNA片段,将所得片段与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,对阳性克隆酶切鉴定和测序;用琼脂平皿二倍稀释法对重组菌株进行药敏测定并测定泵抑制剂CCCP对MIC值的影响;通过RT-PCR从mRNA水平检测emrE的表达水平;通过Genbank数据库对基因序列进行同源性比对,建立进化树并分析同源基因之间的关系。结果含emrE基因质粒可以提高大肠埃希菌对四环素耐药性1倍,对红霉素的耐药性1倍;对emrE基因的同源分析显示H24菌株和大肠埃希菌、其它志贺菌可归为相近一族,同源性在92%以上,与同属于肠杆菌科的欧文杆菌和沙门菌的同源性分别为70%和60%;与亲缘关系较远革兰阳性菌除虫链霉菌和结核分枝杆菌的同源性仅为47%和48%。结论志贺菌耐药株H24的emrE基因与对四环素及红霉素的耐药性相关,依据现有数据进行的emrE基因同源分析未发现有明显的基因水平转移现象。

嗜麦芽寡养单胞菌临床株多重耐药外排泵SmeDEF调控基因smeT的序列分析

目的了解嗜麦芽寡养单胞菌的临床株中,SmeDEF外排泵表达调控基因smeT与耐药性有关的序列变化。方法对嗜麦芽寡养单胞菌smeD-smeT基因间区和部分smeT序列进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列分析;提取的RNA并加聚A尾,对smeT的3′端进行分析。结果选取耐药、敏感的泵抑制阳性株和耐药、敏感的泵抑制阴性嗜麦芽寡养单胞菌7株;发现对氟喹诺酮类耐药的泵抑制阳性菌的smeD-smeT间区测序基因序列与敏感株明显不同;所检测7株菌无论敏感或耐药在SmeT序列的166位氨基酸均为Leu,泵抑制阳性耐药株的SmeT序列在218位氨基酸为Asp/Glu替换。结论嗜麦芽寡养单胞菌临床株在相应于smeT的-165^-82区序列差异,以及SmeT的Asp218Glu氨基酸替换和多个位点的突变可能与多重外排的耐药有关。

多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵基因和外膜蛋白基因的检测

目的了解鲍曼不动杆菌主动外排系统和外膜蛋白基因的表达情况,探讨其在介导细菌多重耐药中的作用。方法 K-B法和琼脂二倍稀释法检测100株鲍曼不动杆菌临床分离株的药物敏感性;PCR扩增adeB、adeJ、carO基因;实时荧光定量PCR检测外排泵AdeABC、AdeIJK的mRNA表达水平。结果 100株中有75株多重耐药株,对米诺环素和多黏菌素B的耐药率分别为60.0%和0%;多重耐药组与敏感组adeB基因阳性率分别为82.7%(62/75)和44.0%(11/25),carO基因阳性率分别为98.7%(74/75)和40.0%(10/25),差异均有统计学意义(χ2分别为14.223和48.016,P均<0.05)。敏感和多重耐药两组间adeB基因相对表达量差异有统计学意义(t=4.209,P<0.01),而两组间adeJ基因相对表达量结果无显著性差异。结论鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药情况严重;adeB基因在多重耐药及部分敏感株中表达量明显增加;AdeABC主动外排系统在鲍曼不动杆菌多重耐药性的形成中具有一定的作用。