siRNA干扰铜绿假单胞菌MexAB—OprM外排泵MexB基因表达的体内效应研究

目的探讨RNA分子干扰铜绿假单胞菌MexAB—OprM外排泵MexB基因的体内效应。方法针对MexAB-OprM外排泵MexB基因设计siRNA小分子，构建干扰RNA（shRNA）表达载体，将带有小分子干扰RNA（siRNA）质粒电转入铜绿假单胞菌，从小鼠支气管内直接予以siRNA质粒干扰PAO琼脂菌体悬液（1×10^7CFU／ml）攻击，建立PA01野生型及siRNA2干扰型和siRNA阴性对照分子干扰型菌株的肺部感染动物模型。于感染后第1、2、3天腹腔注射美罗培南（100mg／kg，2次／d）。感染后第3、5、7天评估各组小鼠肺部细菌学、肺部病理学、细胞因子水平及肺组织中性粒细胞募集（MPO）水平变化。结果siRNA2干扰组小鼠，感染后3、5、7d的肺部细菌负荷明显下降。且与siRNAnon组和ScrambledsiRNA组比较，siRNA2干扰组小鼠感染早期（3d）病理学改变明显减轻；MPO及炎性细胞因子（IL-1β和IL-12）表达水平升高。而在感染后期（7d）siRNA2干扰组小鼠炎性细胞因子表达水平则下降。结论siRNA分子干扰明显增加小鼠对铜绿假单胞菌感染的抵抗力，降低肺部细菌的载量，增加早期中性粒细胞募集到感染部位并诱导铜绿假单胞菌的早期免疫应答。siRNA分子联合抗生素的治疗，为慢性铜绿假单胞菌肺部感染的治疗提供了有意义的资料。

应用siRNA干扰技术沉默铜绿假单胞菌外排泵基因mexB的蛋白表达

目的 观察siRNA干扰质粒转入铜绿假单胞菌后,MexB蛋白表达量的变化.方法 针对mexB基因设计合成特异性siRNA分子,与pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建pGPU6/GFP/NeosiRNA重组质粒.构建重组表达质粒pET22b＋/mexB,并转化大肠杆菌BL21（ DE3） plysS,诱导表达MexB蛋白,蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体.siRNA质粒分别电转化铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株,运用Western blot观察转化8、12、24h后MexB蛋白表达量的变化.结果 成功构建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重组质粒.成功表达铜绿假单胞菌外排泵蛋白MexB,并制备多克隆兔抗.siRNA质粒对铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株的mexB基因均具有良好的沉默效果,而且沉默效果存在时间差异性.结论 siRNA质粒转化3株铜绿假单胞菌后,在8h及12 h时均可观察到MexB蛋白表达量明显减少,而在24 h时MexB蛋白表达量无改变.