猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的截短表达及胶体金免疫层析法的建立

为建立一种快速、便捷的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的胶体金免疫层析方法,本试验通过原核表达截短的M基因作为检测线,葡萄球菌A蛋白(SPA)和鸡抗SPA作为金标抗原和质控线。结果显示,该试纸条与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒2型(PCV2),均不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1∶6400,灵敏性高;批间、批内无差异性;4℃可保存30 d,稳定性好;临床样品检测结果与爱德士试剂盒符合率达到94.82%。综上所述,本试验建立了一种敏感性高、特异性好的PRRSV抗体检测的免疫层析试纸条,为PRRSV的监测、预防及诊断提供了技术支持。

鸡传染性支气管炎病毒广西流行株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,应用RT-PCR方法对2004-2007年的7株广西IBV分离株的纤突蛋白S1基因、核(N)蛋白和膜(M)蛋白基因进行扩增、克隆、测序和同源性比较及系统进化分析。结果显示广西IBV分离株S1基因存在广泛的基因点突变,部分毒株出现基因插入和缺失,分离株之间氨基酸同源性为74.2%～98.7%;N基因无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为91.7%～99.3%;M基因存在点突变和插入现象,分离株之间氨基酸同源性为90.7%～98.2%。以疫苗株H120为参照,广西IBV分离株的S1、N和M基因都出现了变异,其中S1基因变异程度最大。7株广西IBV在S1、N和M基因氨基酸序列系统进化树中分别集中在2、3和3个基因群中,其中4株的S1、N和M基因分型结果不一致。结果表明广西IBV分离株的S1、N和M基因已发生变异,广西IBV存在广泛的基因突变、缺失或插入现象。研究的结果提示流行株的遗传变异可能是目前影响疫苗免疫效果的主要原因。

猪流行性腹泻病毒YL112株的M基因序列分析及其在Vero细胞的传代适应性研究

为了解PEDV YL112株与其他不同来源PEDV毒株之间在分子生物学上的差异,对PEDV YL112株的M基因进行了扩增和序列分析。结果表明:PEDV YL112株与参考株的M基因核苷酸同源性在97.9%~99.8%之间,显示出高度保守性。系统进化树分析表明,PEDV YL112株与经典株CV777的亲缘关系较远,而与我国地方流行毒株HLJBY分离株以及HN-XYYYP-2007的亲缘关系较近。为进一步了解该毒株的复制特征,采用Vero细胞对PEDV YL112株进行体外细胞传代适应性研究。结果表明:经过连续传代培养后,PEDV YL112株对Vero细胞的适应性显著增强,其滴度从第5代的104.8 TCID50/0.1m L提高至第40代的10^(7.6) TCID_(50)/0.1m L。本研究对于分析PEDV的遗传变异规律、了解病毒的致病特征及开发新型疫苗等均具有重要理论和现实意义。

猪流行性腹泻病毒通用实时荧光定量RT-PCR方法的建立与初步应用

以猪流行性腹泻病毒(PEDV)一段保守的M基因序列为靶标,建立可匹配96.93%现有毒株的PEDV实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化反应条件后绘制标准曲线,相关系数R2=0.9995,线性关系良好。该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪链球菌、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒无交叉反应,特异性良好。灵敏度和重复性试验结果显示对PEDV的最低检测限为2.10 copies/μL,且批内、批间重复试验的变异系数均小于2%。用该方法与本病原行业标准方法对162份临床样本进行同批对比检测,结果与行业标准方法的阳性符合率为100%。结果表明,本方法特异性、灵敏度、重复性好,能够有效检测病毒GⅠ和GⅡ基因型,能对导致猪群腹泻的PEDV进行早期确诊。

A型流感病毒M基因DNA疫苗载体构建及免疫性研究

目的构建A型流感病毒M基因DNA疫苗质粒载体并对免疫后小鼠体内免疫应答反应进行分析和评价。方法将H3N2亚型流感病毒M基因通过RT-PCR扩增后克隆构建DNA疫苗载体pBudCE4.1-M,并将pBudCE4.1-M质粒体外瞬时转染COS7细胞并通过Western blot鉴定M1蛋白的表达,然后将pBudCE4.1-M质粒免疫小鼠,通过ELISA对小鼠体内生成的M1蛋白lgG抗体进行鉴定。结果 M基因被成功克隆到质粒载体pBudCE4.1上,并在体外COS7细胞中表达出28kD的M1蛋白。疫苗质粒免疫小鼠后4周,在小鼠血清中检测到M1蛋白lgG抗体的吸光度有明显升高。结论成功构建了一种A型流感病毒M基因DNA疫苗载体,将其免疫小鼠后成功诱导小鼠体内产生了特异性的lgG抗体。