人源HDAC1/2-RbAp46/48核心复合物三维空间构象的电子显微分析

HDAC1、HDAC2和RbAp46、RbAp48是许多重要功能复合物(如NuRD、Sin3等)的核心亚基.这4个亚基在空间上相互作用,形成一个具有去乙酰化酶活性的核心复合物.但该核心复合物的三维空间构象及其对去乙酰化、染色质重塑等功能的可能影响还所知甚少.本研究中,我们包装了含4个亚基的杆状病毒,利用昆虫细胞表达、纯化了HDAC1/2-RbAp46/48核心复合物.在此基础上,利用电子显微镜单颗粒分析方法对该去乙酰化酶核心复合物的三维结构进行了初步解析.结果表明,HDAC1、HDAC2、RbAp46和RbAp48可以形成一个较为稳定均一的复合物,但该复合物中各个亚基并不是以单拷贝、等比例形式存在的.该核心复合物呈现一个非对称的鞍型结构,其背部隆起,大致形成一个三角形,两边分别有一大一小的两翼,两翼中间有个凹槽,直径大约为6 nm,推测为该核心复合物与核小体的结合位置.本研究结果为了解HDAC1/2-RbAp46/48去乙酰化酶复合物各亚基的空间结构组成、与核小体和染色质的可能相互作用以及研究去乙酰化酶活性的作用机理等提供了有益的信息.

核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物的负染电镜结构分析

目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG binding domain protein 3)和N端带有10×His标签的GATAD2A(GATA zinc finger domain containing 2A)克隆至pMLink表达载体中,采用聚乙烯亚胺瞬时转染过表达的方式在人源Expi293F悬浮细胞里表达NuRD复合物中的蛋白质组分;依次通过Ni-NTA亲和层析、Flag(DYKDDDDK)标签亲和层析和Superose 6 Increase 5/150凝胶过滤层析分离纯化NuRD复合物;利用蛋白质印迹法(Western blotting)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对复合物进行组分鉴定;利用负染电镜技术结合单颗粒重构技术研究NuRD复合物的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中已有亚复合物的原子结构模型(7AO9,5FXY)与生成的结构模型进行自动匹配及比对,预测多个蛋白组分在负染结构模型中的定位。结果·利用两步亲和层析,成功富集了带有纯化标签的MBD3、GATAD2A蛋白及其他内源蛋白组分,通过进一步的凝胶过滤层析分离得到了均一性良好的复合物;通过Western blotting和LC-MS/MS鉴定,确认纯化得到的复合物为组分完整的人源NuRD复合物。利用负染电镜技术及单颗粒重构技术初步解析了NuRD复合物的空间结构,其整体轮廓特征明显,呈现为不对称的长条形;通过进一步的三维优化处理,最终获得了人源NuRD复合物分辨率约为17A(1A=0.1 nm)的初步三维结构模型;已有的亚复合物原子结构模型(PDB:7AO9,5FXY)与NuRD复合物的初步三维结构模型自动匹配后,初步确定了MTA1/2/3(metastasis-associated protein 1/2/3)、HDAC1/2(histone deacetylase 1/2)、RBBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4/7)及MBD2/3(methyl-CpG-binding domain protein 2/3)蛋白亚基在NuRD复合物负染结构模型中的定位。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源NuRD复合物的低分辨率负染结构模型。

核小体重塑与去乙酰化酶复合物在γ珠蛋白调控中作用的研究进展

核小体重塑与去乙酰化酶(NuRD)复合物是同时具有组蛋白去乙酰化和染色质重塑活性的独特复合物, 在转录调节和DNA损伤修复过程中发挥重要功能。近年研究发现, NuRD复合物在γ珠蛋白的调控中, 亦发挥重要作用。NuRD复合物中的多个亚基, 如染色质螺旋酶DNA结合蛋白(CHD)、甲基化CpG结合蛋白(MBD)、GATA锌指结合域蛋白(GATAD)2、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)1/2, 以及转移相关蛋白(MTA)亚基等, 通过不同机制参与沉默γ珠蛋白表达, 并且NuRD复合物与其他调控γ珠蛋白表达的转录因子之间亦有相互作用。基于提升γ珠蛋白的表达是治疗β血红蛋白病的策略之一, 笔者拟就NuRD复合物及其亚基在γ珠蛋白表达调控中的具体机制的研究进展进行综述, 旨在为治疗β血红蛋白病寻找新的分子调控靶点提供参考。