南方根结线虫MiPDCD6基因多克隆抗体的制备

【目的】制备针对南方根结线虫食道腺蛋白MiPDCD6多克隆抗体,为进一步研究南方根结线虫MiPDCD6蛋白的致病机制提供技术支持和材料准备。【方法】将扩增MiPDCD6基因的功能片段,与原核表达质粒pET-32a(+)构建重组质粒pET-32a-MiPDCD6,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞进行诱导表达;将纯化的根结线虫Mi PDCD6融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,获得高效价高纯度的多克隆抗体。【结果】构建的重组质粒pET-32a-MiPDCD6转化大肠杆菌BL21细胞后,在诱导剂IPTG浓度1.0 mmol·L^(-1)、摇床温度37℃、转速150r·min^(-1)和振荡培养5 h条件下,成功表达MiPDCD6融合蛋白。ELISA和SDS-PAGE检测表明:将纯化的根结线虫Mi PDCD6融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,获得高效价高纯度的多克隆抗体,效价约为1∶50 000。【结论】明确了MiPDCD6基因原核表达条件;制备获得的根结线虫MiPDCD6蛋白的多克隆抗体效价和纯度较高,可用于后续研究MiPDCD6蛋白在南方根结线虫致病机理中发挥的功能。

基于RNA-seq的番茄响应根结线虫MiPDCD6蛋白的SA信号通路基因鉴定与表达分析

为了揭示南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄PTI免疫的分子机理,以番茄品种新金丰1号MiPDCD6超表达苗为试验材料,以番茄品种新金丰1号组培苗为对照,通过转录组测序技术分别对番茄MiPDCD6超表达苗和对照苗进行转录组测序。以番茄栽培品种Heinz 1706基因组作为参考基因组进行对比,利用FPKM法计算基因表达量,设定参数(|log_(2)FC|>1且P<0.05)筛选差异表达基因。利用Gene Ontology(GO)数据库进行差异表达基因GO功能富集分析,统计每个GO term中的差异表达基因数目,计算出基因富集的显著性,找出富集显著的功能条目。利用KEGG数据库对差异表达基因进行Pathway富集分析,超几何分布检验方法计算每个Pathway中差异表达基因富集的显著性。以FDR和基因数量来衡量KEGG的富集程度。结合基因差异表达分析和功能富集分析,研究MiPDCD6蛋白对番茄PTI免疫相关通路基因的影响。结果发现:在超表达MiPDCD6番茄植株中,与野生型番茄相比,MiPDCD6过表达番茄植株中有2366个差异表达基因(DEGs),其中1354个上调基因,1012个下调基因。这些DEGs中,通过GO和KEGG注释,植物激素信号转导(sly04075)、植物-病原互作(sly04626)、植物MAPK信号通路(sly04016)和丙环素生物合成(sly00940)等KEGG通路中富集到大量的差异表达基因。SA生物合成途径包括ICS和PAL,MiPDCD6过表达番茄植株中SA合成通路PAL1和PAL-like基因以及SA信号转导途径TGA9、TGA10-like和PR1a2基因均显著下调,表明MiPDCD6基因可能抑制SA合成,从而抑制植物PTI免疫。