乙型肝炎病毒通过miR⁃154⁃5p/STAT3轴促进肝癌细胞的增殖和迁移

探讨乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)通过miR⁃154⁃5p/STAT3轴促进肝癌细胞增殖和迁移的影响。用含有1.3倍超长HBV基因组的腺病毒感染HepG2细胞,以正常HepG2作为对照(NC),记为HBV组和NC组。采用实时荧光定量PCR(qRT⁃PCR)检测HBV组、NC组、稳定表达HBV的人肝癌细胞HepG2.2.15及人肝癌细胞HepG2中miR⁃154⁃5p表达水平。按照脂质体法将miR⁃NC模拟物、过表达miR⁃154⁃5p、过表达miR⁃154⁃5p+空载体pcDNA、过表达miR⁃154⁃5p+过表达STAT3转染至HepG2.2.15细胞中,记为miR⁃NC组、miR⁃154⁃5p组、miR⁃154⁃5p+pcDNA组、miR⁃154⁃5p+STAT3组。细胞计数试剂盒(CCK8)、克隆形成实验检测细胞增殖;伤口愈合实验检测细胞迁移;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测信号转导与转录因子3(STAT3)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白表达。荧光素酶实验检测miR⁃154⁃5p和STAT3的关系。与NC组相比,HBV组内miR⁃154⁃5p表达水平降低;与HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞中miR⁃154⁃5p表达水平明显降低。上调miR⁃154⁃5p明显降低细胞活性、克隆形成数、迁移率,并抑制了PCNA、MMP2和MMP9蛋白表达。miR⁃154⁃5p靶向负调控STAT3的表达,且过表达STAT3可以逆转上调miR⁃154⁃5p对HepG2.2.15细胞增殖、迁移的抑制作用。乙型肝炎病毒通过降低miR⁃154⁃5p表达上调STAT3,进而促进肝癌细胞的增殖和迁移。

miR⁃21⁃5p靶向BNC2调控食管癌的恶性生物行为的研究

目的:探讨miR-21-5p靶向肌成纤维细胞的身份转录因子(BNC2)调控食管癌(esophageal cancer,ESCA)细胞增殖、迁移、侵袭机制。方法:应用实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测食管癌组织中miR-21-5P和BNC2的相对表达量并用统计学分析其是否存在表达差异。用miR-21-5p mimics和miR-21-5P inhibitor和阴性对照(NC包括mimcs NC、inhibitor NC)分别转染ECA109、KYSE30两个食管癌细胞系后,进行细胞功能试验CCK8,Transwell等实验方法观察当miR-21-5p过表达或敲低时细胞的增殖、迁移和侵袭能力是否受到影响。通过生物信息学方法预测分析miR-21-5P的靶基因并通过双荧光素酶实验、qRT-PCR和Western blot实验验证miR-21-5p与靶向基因的负向调控关系。结果:qRT-PCR结果显示,相对于癌旁组织,BNC2在食管癌组织中的表达量显著性降低,而miR-21-5P则显著性升高,CCK8、Transwell实验结果显示,当miR-21-5P过表达时,细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强,反之细胞功能受到抑制。也就是说,miR-21-5P在食管恶性肿瘤中起着促癌基因的功能作用。通过生物信息学方法预测miR-21-5P的靶基因为BNC2,双荧光素酶实验结果表明miR-21-5P与野生型BNC2′-UTR靶向结合,qRT-PCR和WB实验结果表示在食管癌细胞中,当miR-21-5P过表达时,BNC2的表达量降低,当miR-21-5P被敲低时,BNC2的表达量升高。这些结果显示miR-21-5P与BNC2存在靶向关系。结论:在食管癌中,miR-21-5p直接靶向BNC2,其调节作用可能从而导致癌症的增殖迁移和侵袭作用。

miR⁃138⁃5p靶向Nir1调控胶质瘤细胞的侵袭

目的 探讨miR-138-5p与PYK2 N端结构域相互作用受体1(PYK2 N-terminal domain-interacting receptor 1,Nir1)之间的关系并判断其是否通过与Nir1结合影响胶质瘤的侵袭。方法 比较不同胶质瘤细胞系中miR-138-5p表达水平及其对胶质瘤细胞U251和H4中Nir1蛋白的影响、转染后胶质瘤细胞侵袭能力,检测miR-138-5p能否与Nir1靶向结合。结果 低侵袭人胶质瘤H4细胞中miR-138-5p的水平显著高于高侵袭性的胶质瘤U251、LN229和U87细胞(P<0.05);在U251、H4细胞中,miR-138-5p过表达组Nir1蛋白表达量较其对照组(miR-negative control,miR-NC)降低;miR-138-5p抑制组中Nir1蛋白表达量较其对照组(inhibitor NC)升高。然而,miR-138-5p过表达组中Nir1的mRNA水平较其对照组无明显改变(P>0.05)。miR-138-5p过表达组穿过基底膜小孔的U251、H4细胞数明显少于其对照组(P<0.05)。miR-138-5p过表达显著降低Nir1-3’-UTR的荧光素酶活性。结论 胶质瘤细胞中miR-138-5p与Nir1结合,可通过降低Nir1的翻译、减少Nir1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。

miR⁃138⁃5p在骨关节炎中作用机制的研究进展

miR⁃138⁃5p作为一种微小RNA,在骨关节炎发病中起重要调节作用,其可通过NF⁃κB、Wnt/β⁃catenin、PI3K/AKT等信号通路作用调节细胞的炎症、细胞凋亡与增殖、基质降解等生物学过程进而影响骨关节炎的发生和发展。笔者就miR⁃138⁃5p对骨关节炎作用机制的研究进展作一综述。

miR‑15a‑5p对子痫前期胎盘滋养细胞自噬的影响

目的探讨miR‑15a‑5p对子痫前期胎盘滋养细胞自噬的影响。方法收集2020年12月至2022年12月的正常妊娠胎盘组织和子痫前期胎盘组织各20例。采用荧光定量PCR检测胎盘组织和滋养细胞中miR‑15a‑5p的表达,并对其表达水平与患者血压做相关性分析;将HTR8‑S/Vneo细胞分正常组(control)和缺氧组(hypoxia),观察缺氧对miR‑15a‑5p表达的影响。另设mimic‑NC组、mimic‑NC+hypoxia组、miR‑15a‑5p mimic组、miR‑15a‑5p mimic+hypoxia、inhibitor‑NC组、inhibitor‑NC+hypoxia、miR‑15a‑5p inhibitor组、miR‑15a‑5p inhibitor+hypoxia组,观察miR‑15a‑5p对缺氧诱导的滋养细胞自噬相关蛋白LC3B和p62蛋白的影响。用Western blot检测各组中自噬相关蛋白LC3B和p62蛋白的表达水平;TargetScan网站预测miR‑15a‑5p的靶基因,检测其在胎盘组织和滋养细胞中的表达水平。结果与对照组相比,miR‑15a‑5p在子痫前期胎盘组织和缺氧滋养细胞中的表达均增高,且与患者血压呈正相关;缺氧条件下过表达miR‑15a‑5p,LC3BⅡ/Ⅰ表达增高,P62蛋白相对表达量降低;干扰miR‑15a‑5p后,LC3BⅡ/Ⅰ表达量降低,p62蛋白表达量升高;荧光定量PCR及Western blot检测结果发现YAP1在子痫前期胎盘组织和缺氧滋养细胞中的表达水平明显降低。结论miR‑15a‑5p在子痫前期胎盘滋养细胞中的高表达,其可能通过与YAP1结合从而促进PE自噬的发生。

内质网应激头颈部鳞状细胞癌细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路促进巨噬细胞PD⁃L1表达

目的探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squa⁃mous cell carcinoma,HNSCC)细胞分泌的外泌体miRNA表达变化对巨噬细胞的影响机制。方法本研究已通过单位伦理委员会审查批准。通过蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)和实时荧光定量PCR实验(RT⁃qPCR)检测HNSCC肿瘤组织及癌旁组织ERS相关蛋白,包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R⁃like endoplas⁃mic reticulum kinase,PERK)和葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)的表达水平;以500 U/mL干扰素⁃γ(interferon⁃γ,IFN⁃γ)处理人喉鳞癌细胞系HN4细胞48 h,诱发HN4细胞产生内质网应激反应,收集HN4细胞分泌的外泌体,通过生物信息学分析鉴定外泌体的miRNA种类,预测miRNA的靶基因,将巨噬细胞转染miRNA、与收集的外泌体共培养、并敲低巨噬细胞PTEN表达,以WB和RT⁃qPCR检测外泌体miRNA调控的下游信号通路蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及程序性死亡受体⁃1配体(programmed death receptor ligand 1,PD⁃L1)表达变化。结果HNSCC肿瘤组织相比癌旁组织ERS相关蛋白表达水平升高(P<0.05);RNA测序及实验验证表明ERS的HN4细胞分泌的外泌体miR⁃26a⁃5p表达上调(P<0.05);PTEN是miR⁃26a⁃5p的靶基因,miR⁃26a⁃5p升高巨噬细胞PD⁃L1表达水平,并下调PTEN表达(P<0.05);巨噬细胞与ERS外泌体共培养,miR⁃26a⁃5p和PD⁃L1表达上升,PTEN表达下降,p⁃AKT表达升高(P<0.05);敲低巨噬细胞PTEN表达,PD⁃L1表达上升(P<0.01)。结论ERS的HNSCC细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路及PD⁃L1的表达。

原花青素B2通过miR⁃499⁃5p促进骨骼肌慢肌纤维基因的表达

旨在探究原花青素B2(Proanthocyanidins B2,PB2)是否通过miR⁃499⁃5p调控骨骼肌慢肌纤维基因的表达.在小鼠C2C12细胞和猪骨骼肌卫星细胞诱导分化形成肌管后,分别向肌管中添加0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的PB2,探究不同浓度PB2对慢肌纤维基因表达的影响.在机制研究试验中,分别向C2C12肌管和猪肌管中添加10μg/mL的PB2,同时转染200 nM的miR⁃499⁃5p inhibitor抑制miR⁃499⁃5p的表达.结果表明,不同添加剂量的PB2均可促进C2C12肌管MyHC I基因的表达(P<0.05);添加5μg/mL和10μg/mL的PB2显著增加猪肌管MyHC I基因的表达(P<0.05);添加5μg/mL和10μg/mL的PB2上调C2C12肌管和猪肌管miR⁃499⁃5p的表达水平(P<0.05).机制研究发现,抑制miR⁃499⁃5p解除了PB2对miR⁃499⁃5p、MyHC I mRNA和慢型MyHC蛋白表达的促进作用.以上研究表明,PB2可以通过miR⁃499⁃5p促进骨骼肌慢肌纤维基因的表达.

LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p调控 ITGA6表达对非小细胞肺癌增殖与迁移的影响

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIR503HG、微小RNA(miRNAs)-32-5p、整合素α(ITGA)6在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其对NSCLC细胞增殖和迁移的影响。方法 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中提取273例NSCLC患者癌组织及其对应癌旁组织的LncRNA、miRNA及转录组mRNA的芯片数据,R软件中MAX STAT函数包统计分析LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6在NSCLC中的表达。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测80例NSCLC患者癌组织标本和NSCLC细胞系中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6 mRNA表达。双荧光素酶实验证明LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6的关系。依次以LncRNA MIR503HG-mimic-NC、LncRNA MIR503HG-mimic、miR-32-5p-agomir-NC、miR-32-5p-agomir、LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir、LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6、miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6转染H1299细胞,另设定正常(Normal)组细胞。EDU染色实验与Transwell小室实验检测各组细胞体外增殖与转移活性;裸鼠体内皮下种植肿瘤模型检测细胞体内生长与转移能力。Western印迹检测ITGA6、E-钙黏蛋白(cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达。结果 在线分析结果显示,与癌旁组织和BEAS-2B细胞相比,LncRNA MIR503HG、ITGA6 mRNA在NSCLC组织和NSCLC细胞表达升高,miR-32-5p mRNA下降,差异具有统计意义(均P<0.05)。双荧光素酶实验证实LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p表达,miR-32-5p靶向ITGA6表达。过表达LncRNA MIR503HG可增强H1299细胞的体外增殖与转移及体内生长与转移能力,ITGA6和Vimentin表达升高,E-cadherin表达降低,miR-32-5p-agomir可部分逆转这一作用,而pcDNA3.1-ITGA6可部分修复这一逆转作用,差异均具有统计意义(P<0.05)。结论 下调LncRNA MIR503HG表达能降低H1299细胞增殖与转移能力,发挥抑癌效应,其机制可能与靶向miR-32-5p调控ITGA6表达水平有关,为NSCLC的治疗提供靶点。

lncRNA SNHG10下调miR-154-5p对非小细胞肺癌细胞的影响

目的分析长链非编码RNA(LncRNA)小核仁RNA宿主基因10(SNHG10)通过海绵化微小RNA-154-5p(miR-154-5p)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移及紫杉醇(PTX)耐药的影响。方法体外培养人NSCLC A549细胞,随机转染不同质粒,分别记为pcDNA-SNHG10组、pcDNA阴性对照(pcDNA-NC)组、miR-154-5p抑制物(anti-miR-154-5p)组、抑制物阴性对照(anti-NC)组、miR-154-5p类似物(mimics)+pcDNA-SNHG10组、mimics阴性对照(miR-NC)+pcDNA-SNHG10组。实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中SNHG10、miR-154-5p的表达;MTT法检测细胞增殖及PTX敏感性;Transwell检测细胞迁移、侵袭;双荧光素酶报告实验检测SNHG10与miR-154-5p的靶向关系;Western blot法检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)、微小染色体维持蛋白(MCMP)、Bcl-2、Bax水平。结果过表达SNHG10或抑制miR-154-5p表达后,A549细胞PTX IC 50值、迁移及侵袭细胞数、MRP1、MCMP及Bcl-2蛋白下降,细胞增殖抑制率及Bax蛋白水平升高(P<0.05)。SNHG10负调控miR-154-5p。上调miR-154-5p可逆转SNHG10过表达对A549细胞PTX IC50值、迁移、侵袭、增殖、MRP1、MCMP、Bcl-2、Bax蛋白的影响(P<0.05)。结论SNHG10可通过靶向miR-154-5p抑制A549细胞增殖、迁移、侵袭,提高A549细胞PTX敏感性。

LncRNA MIR22HG通过海绵吸附miR-22-5p对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡和炎性反应的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIR22HG对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLSs)增殖、凋亡和炎性反应的影响及其分子机制。方法收集在本院接受治疗的37例RA患者及30例关节创伤患者的滑膜组织样本,采用qRT-PCR检测滑膜组织中MIR22HG和miR-22-5p表达水平。体外分离、培养和鉴定人RA-FLSs,将MIR22HG siRNA干扰质粒(si-MIR22HG)及其阴性对照质粒(si-NC)和miR-22-5p inhibitor及其阴性对照(inhibitor-NC)分别或同时转染至RA-FLSs中,qRT-PCR检测细胞中MIR22HG和miR-22-5p表达水平;CCK-8检测各组细胞增殖活性;Annexin Ⅴ-FITC/PI检测各组细胞凋亡率;ELISA检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平;Western blot检测各组细胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证MIR22HG与miR-22-5p之间的靶向关系。结果与关节创伤患者比较,RA患者滑膜组织中MIR22HG表达水平升高(P<0.05),而miR-22-5p表达水平降低(P<0.05)。干扰MIR22HG可抑制RA-FLSs增殖活性,降低细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平及细胞中Bcl-2蛋白表达水平(P<0.05),提高细胞凋亡率、miR-22-5p及Bax、Cleaved casepase-3等蛋白表达水平(P<0.05)。然而,抑制miR-22-5p表达可逆转MIR22HG基因沉默对RA-FLSs增殖、凋亡和炎症的影响(P<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,miR-22-5p是MIR22HG潜在的下游靶miRNA。结论MIR22HG在RA患者关节滑膜组织中高表达,其可能通过靶向下调miR-22-5p表达促进RA-FLSs增殖及炎性反应,并抑制细胞凋亡。

基于mTOR/P70S6K通路研究上调miR-205-5p对肝癌细胞增殖、侵袭的影响

目的基于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体S6蛋白激酶(P70S6K)通路研究上调微小核糖核酸(miR)-205-5p对肝癌细胞增殖、侵袭的影响。方法肝癌HepG2细胞株经过细胞培养、转染后,分为上调miR-205-5p组、肝癌组和阴性对照组。实时荧光定量(RT)-聚合酶链反应(PCR)检测miR-205-5p表达,观察肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力,Western印迹检测p-mTOR、p-P70S6K、mTOR、P70S6K蛋白表达。结果上调miR-205-5p组miR-205-5p表达显著高于肝癌组和阴性对照组,阴性对照组显著高于肝癌组(均P<0.05)。在24、48、72 h,上调miR-205-5p组细胞光密度值均显著低于阴性对照组和肝癌组,阴性对照组光密度值均显著低于肝癌组,在72 h差异表现最为明显(P<0.05),阴性对照组和肝癌组随着时间延长,光密度值逐渐显著升高,上调miR-205-5p组光密度值逐渐显著降低(均P<0.05)。上调miR-205-5p组72 h细胞增殖数、细胞侵袭数显著低于肝癌组和阴性对照组,细胞凋亡数显著高于肝癌组和阴性对照组(均P<0.05)。上调miR-205-5p组mTOR、P70S6K、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表达显著低于肝癌组和阴性对照组(均P<0.05)。结论上调miR-205-5p可以影响mTOR/P70S6K信号通路的活性,参与肝癌细胞侵袭、增殖、凋亡的过程。

CircSMC3调节miR-582-5p/MCL1轴对胃癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的:探讨环状非编码RNA(CircRNA)SMC3通过调节微小RNA(miR)-582-5p/髓细胞白血病基因1(MCL1)轴对胃癌(GC)细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:qRT-PCR检测4种GC细胞系及正常胃上皮细胞系GES-1中SMC3、miR-582-5p、MCL1mRNA的表达水平。将SGC-7901细胞分为对照组、si-NC组、si-SMC3组、mimics NC组、miR-582-5p组、si-SMC3+inhibitor NC组、si-SMC3+miR-582-5p inhibitor组、miR-582-5p+pcDNA3.1组、miR-582-5p+MCL1组。检测各细胞凋亡、增殖、迁移及相关蛋白表达的情况;验证miR-582-5p与SMC3、MCL1的靶向关系。结果:4种GC细胞系中SMC3、MCL1 mRNA表达均增加,miR-582-5p表达下降(P<0.05)。干扰SMC3、过表达miR-582-5p可以抑制SGC-7901细胞增殖、迁移及相关蛋白、表达(P<0.05);抑制miR-582-5p表达可逆转干扰SMC3对细胞的作用(P<0.05);上调MCL1可逆转过表达miR-582-5p细胞的作用(P<0.05)。结论:干扰SMC3可能通过调节miR-582-5p/MCL1轴,抑制SGC-7901细胞增殖、迁移,促进凋亡。

LINC00662通过调控miR⁃106a⁃5p/CAV1轴影响肝癌细胞对索拉非尼药物的敏感性

目的:探究长链非编码RNA⁃LINC00662对诱导肝细胞癌(HCC)细胞索拉非尼耐药的机制。方法:以HCC细胞(HepG2、HCCLM3),索拉非尼耐药肝癌细胞HCC⁃SR(HepG2⁃SR、HCCLM3⁃SR)为研究对象,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT⁃qPCR)和Western blotting检测各组细胞中LINC00662、miR⁃106a⁃5p和小窝蛋白⁃1(CAV1)表达水平。将si⁃LINC00662、miR⁃106a⁃5p模拟物分别转染HCC⁃SR细胞,通过细胞活性试剂盒(CCK⁃8)检测细胞对索拉非尼药物敏感性。且进一步通过双荧光素酶报告实验、RT⁃qPCR、Western blotting确定LINC00662与miR⁃106a⁃5p、miR⁃106a⁃5p与CAV1之间的靶向关系。结果:HCC⁃SR细胞中LINC00662和CAV1相对表达显著升高,miR⁃106a⁃5p表达显著降低(P<0.01,P<0.001);干扰LINC00662表达或过表达miR⁃106a⁃5p,HCC⁃SR细胞对索拉非尼药物敏感性显著升高(P<0.05,P<0.01)。且LINC00662靶向负性调控miR⁃106a⁃5p表达,miR⁃106a⁃5p靶向负性调控CAV1表达(P<0.05)。结论:LINC00662可以作为miR⁃106a⁃5p的竞争性内源性RNA(ceRNA)促进CAV1的表达,介导HCC细胞索拉菲尼的耐药性,干扰LINC00662表达可抑制HCC细胞索拉非尼耐药,增加索拉非尼的敏感性。

铝致大鼠认知功能障碍中miR⁃9⁃5p、RHOA的表达研究

目的:探讨微小RNA‐9‐5p(miR‐9‐5p)、Ras同源基因家族成员A(RHOA)在铝致大鼠认知功能障碍中的可能机制。方法:根据随机分组的原则,把48只Wistar大鼠随机分为对照、低剂量、中剂量、高剂量4个组(n=12)。空白对照组每日灌胃生理盐水,其余组以25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg 3个剂量每天灌胃AlCl3水溶液来创建认知障碍大鼠模型,周期3个月。采用水迷宫(MWM)定位航行实验记录大鼠上平台的时间t(s),即潜伏期,根据各组大鼠的潜伏期来判断染毒组大鼠是否存在学习记忆能力障碍;苏木精‐伊红(HE)、尼氏(Nissl)染色观察4个组的海马区的神经细胞病理变化;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测新鲜大鼠海马组织中RHOA、脑神经性营养因子(BDNF)的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT‐qPCR)检测大鼠海马组织中miR‐9‐5p、RHOA、BDNF的mRNA表达量。结果:Morris水迷宫定位航行试验结果表明,在实验第1、3、5天计算各个组的潜伏期,与对照组相比,染毒组运动潜伏期均高于对照组。HE染色结果显示,对照组大鼠神经细胞形态完整,染色清晰,细胞核清晰可见,胞膜边缘锐利。染毒组大鼠神经元受到不同程度的损伤,细胞核逐渐溶解,细胞质染色变深,细胞膜边缘模糊紊乱,细胞变形,排列紊乱。尼氏染色结果显示,对照组大鼠神经细胞内可见染色清晰的Nissl体颗粒,染毒组神经细胞内Nissl体消散减少,染色较浅。RT‐qPCR结果显示,与对照组相比,染毒组miR‐9‐5p、BDNF的mRNA表达均下降,RHOA的mRNA表达升高(P<0.05或P<0.001)。Western Blot结果显示,与对照组相比,染毒组BDNF的蛋白相对表达量均下降,RHOA的蛋白相对表达量升高(P<0.05)。结论:在铝致大鼠认知障碍中,大鼠海马组织miR‐9‐5p下调,RHOA上调。

过表达miR-486-5p增强鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R放射敏感性

目的探讨鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE⁃2R过表达miR⁃486⁃5p后的放射增敏效应。方法采用microRNA(miRNA)测序和RT⁃qPCR检测miR⁃486⁃5p在鼻咽癌亲本细胞CNE2和放射抗拒细胞CNE⁃2R中的表达水平。使用miR⁃486⁃5p过表达及阴性对照慢病毒液感染CNE⁃2R细胞,分别定义为CNE⁃2R⁃Mimics组和CNE⁃2R⁃NC组,利用CCK⁃8实验、平板克隆形成实验检测细胞增殖能力和经不同照射剂量(0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy)X射线照射后的细胞活力,Annexin V⁃APC/7⁃AAD双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果miRNA测序和RT⁃qPCR结果均显示CNE⁃2R细胞中的miR⁃486⁃5p表达水平低于亲本细胞CNE2。CCK⁃8实验结果显示,培养48 h、72 h、96 h后,过表达miR⁃486⁃5p的CNE⁃2R细胞增殖能力较CNE⁃2R⁃NC组减弱(均P<0.05);经2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy照射剂量照射后,CNE⁃2R⁃Mimics组存活分数低于CNE⁃2R⁃NC组(均P<0.05),其中在8 Gy照射剂量下两组存活分数差异最大(t=30.152,P<0.001)。流式细胞术实验结果显示,在未照射(0 Gy)和8 Gy照射剂量下,CNE⁃2R⁃Mimics组凋亡率均高于CNE⁃2R⁃NC组(均P<0.05),其中在8 Gy剂量照射下细胞凋亡率差异更显著(t=14.945,P<0.001)。平板克隆形成实验结果显示,在不同照射剂量照射下,CNE⁃2R⁃Mimics组克隆形成数均低于CNE⁃2R⁃NC组,其中CNE⁃2R⁃Mimics组的放射生物学参数D0、Dq和照射2 Gy时的存活分数均小于CNE⁃2R⁃NC组(均P<0.05)。结论鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE⁃2R过表达miR⁃486⁃5p后可能通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来增加放射敏感性。

基于miR⁃224⁃5P调控的IL6ST/JAK/STAT信号通路在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用

目的探讨miR⁃224⁃5P在糖尿病视网膜病变(DR)患者中的表达变化及其在高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE⁃19)中的作用和机制。方法抽取DR患者及健康人群各6名的外周血,RT⁃qPCR检测miR⁃224⁃5P相对表达量。将正常培养的ARPE⁃19细胞随机分成高糖组(给予30 mmol·L^(-1)高糖)、高糖+miR⁃224⁃5P mimics组(转染100 nmol·L^(-1) miR⁃224⁃5P mimics后给予30 mmol·L^(-1)高糖)、高糖+miR⁃224⁃5P inhibitor组(转染100 nmol·L^(-1) miR⁃224⁃5P inhibitor后给予30 mmol·L^(-1)高糖)、高糖+OE⁃IL6ST组(转染100 nmol·L^(-1) OE⁃IL6ST后给予30 mmol·L^(-1)高糖)和高糖+miR⁃224⁃5P mimics+OE⁃IL6ST组(转染100 nmol·L^(-1) miR⁃224⁃5P mimics和100 nmol·L^(-1) OE⁃IL6ST后给予30 mmol·L^(-1)高糖),CCK⁃8检测细胞活力,Transwell检测细胞迁移率,双荧光素酶实验验证miR⁃224⁃5P与IL6ST的靶向关系,Western blot检测IL6ST、P⁃JAK及P⁃STAT蛋白表达,ELISA检测细胞中IL⁃1β、IL⁃6及TNF⁃α蛋白表达水平。通过过表达IL6ST进一步验证miR⁃224⁃5P是否通过IL6ST/JAK/STAT通路发挥作用。结果DR患者外周血中miR⁃224⁃5P mRNA相对表达量显著低于健康人群(P<0.001)。与高糖组相比,高糖+miR⁃224⁃5P mimics组细胞活力、细胞迁移率增高,高糖+miR⁃224⁃5P inhibitor组细胞活力、细胞迁移率降低(均为P<0.001)。双荧光素酶实验检测结果证实IL6ST是miR⁃224⁃5P调控的靶基因。与高糖组相比,高糖+miR⁃224⁃5P mimics组细胞的IL6ST蛋白表达水平降低,P⁃JAK和P⁃STAT蛋白表达水平升高(均为P<0.05);高糖+miR⁃224⁃5P inhibitor组细胞的IL6ST蛋白表达水平升高(P<0.05),P⁃JAK和P⁃STAT蛋白表达水平降低(均为P<0.05)。与高糖组相比,高糖+miR⁃224⁃5P mimics组细胞的IL⁃1β、IL⁃6及TNF⁃α蛋白表达水平均下降(均为P<0.01),高糖+miR⁃224⁃5P inhibitor组细胞的IL⁃1β、IL⁃6及TNF⁃α蛋白表达水平均显著上升(均为P<0.01)。高糖+miR⁃224⁃5P mimics+OE⁃IL6ST组细胞活力和细胞迁移率均较高糖+miR⁃224⁃5P mimics组显著降低(均为P<0.001)。与高糖+OE⁃IL6ST组相比,高糖+miR⁃224⁃5P mimics+OE⁃IL6ST组细胞的P⁃JAK和P⁃STAT蛋白表达水平均升高(均为P<0.001);与高糖+miR⁃224⁃5P mimics组相比,高糖+miR⁃224⁃5P mimics+OE⁃IL6ST组细胞的P⁃JAK和P⁃STAT蛋白表达水平均降低(均为P<0.001)。结论miR⁃224⁃5P在DR患者血液中表达降低,过表达miR⁃224⁃5P可降低高糖引起的炎症因子表达,并可通过IL6ST/JAK/STAT信号通路增加高糖诱导的ARPE⁃19细胞活力及细胞迁移率,从而调控DR的发生和发展。

下调miR-21-5p对急性脑出血模型大鼠血脑屏障的保护作用及机制

目的分析下调微小RNA(miR)-21-5p对急性脑出血模型大鼠血脑屏障的保护作用及机制。方法48只SPF级SD大鼠,分为空白组、模型组、上调组、下调组各12只,空白组不做任何处理,模型组、上调组、下调组构建急性脑出血大鼠模型,miR-21-5p慢病毒滴定,采用实时荧光定量(RT)-聚合酶联反应(PCR)检测miR-146a基因表达量,采用透射电镜检测血脑屏障通透性,采用酶联免疫吸附试验检测细胞色素(Cyt)-C、基质金属蛋白酶(MMP)-9、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,采用Western印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路蛋白表达量。结果与上调组相比,下调组miR-21-5p表达量明显降低,Cyt-C、MMP-9、血脑屏障通透性、SOD、MDA表达量明显升高,PI3K/Akt信号通路蛋白表达量明显降低(均P<0.05)。结论下调miR-21-5p可能经作用于PI3K/Akt信号通路抑制氧化应激,发挥保护急性脑出血大鼠血脑屏障的作用。

超声微泡介导的膀胱癌抑制因子miR-490-5p调控转录因子ZEB1对膀胱癌细胞的影响研究

目的:探究微泡介导的膀胱癌抑制因子微小核糖核酸(miR)-490-5p调控锌指E-盒结合同源盒蛋白1(ZEB1)对膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:检测人膀胱上皮细胞.人膀胱癌细胞VM-CUB-3、639V和5637、HT-1197细胞中mi R-490-5p和ZEB1 mRNA与蛋白的表达情况。选择人膀胱癌639V细胞株进行实验,对639V细胞给予1%、5%、10%、20%浓度水平的微泡以及超声强度为0.5 W/cm2、0.75 W/cm2的超声照射30 s处理,筛选超声强度为0.5 W/cm2、微泡浓度为10%;将常规培养639V细胞纳入对照组,将培养及微泡制备后的639V细胞分别纳入超声微泡组、超声微泡转染miR-490-5p组、脂质体转染miR-490-5p组及超声微泡转染miR-490-5p+ZEB1组,分别检测5组639V细胞增殖抑制率、侵袭细胞数及划痕愈合率,并用Westernblot法检测5组639V细胞ZEB1、增殖细胞核抗原(PCNA)、钙黏蛋白E(E-cad)和钙黏蛋白N(N-cad)水平。结果:膀胱癌VM-CUB-3、639V、5637和HT-1197细胞与人膀胱上皮细胞相比,miR-490-5p水平降低,ZEB1mRNA和ZEB1蛋白水平均升高,其中639V细胞差异最明显。在超声0.5 W/cm2、微泡浓度10%的处理条件下,超声微泡组细胞增殖抑制率和E-cad蛋白均高于对照组,差异有统计学意义(t=22.282,t=4.517;P<0.05),PCNA蛋白水平、侵袭细胞数和N-cad蛋白和划痕愈合率降低,差异有统计学意义(t=2.441,t=2.325,t=4.572,t=4.417;P<0.05);超声微泡转染miR-490-5p组、脂质体转染miR-490-5p组细胞增殖抑制率、E-cad蛋白高于超声微泡组,差异有统计学意义(t细胞增殖抑制率=16.902,t=12.426;tE-cad=5.586,t=2.765;P<0.05);PCNA蛋白水平、侵袭细胞数、N-cad蛋白和划痕愈合率低于超声微泡组,差异有统计学意义(tPCNA蛋白水平=7.530,t=4.164;t侵袭细胞数=9.007,t=5.682;tN-cad蛋白=8.089,t=4.297;t划痕愈合率=11.366,t=6.665,P<0.05)。超声微泡转染miR-490-5p+ZEB1组细胞增殖抑制率、E-cad蛋白低于超声微泡转染miR-490-5p组,差异有统计学意义(t=2.903,t=6.114,P<0.05),PCNA蛋白水平、侵袭细胞数、N-cad蛋白和划痕愈合率高于超声微泡转染miR-490-5p组,差异有统计学意义(t=6.586,t=4.487,t=5.695,t=4.603,P<0.05);双荧光素酶报告基因显示miR-490-5p与ZEB1存在靶向关系。结论:超声微泡介导的miR-490-5p可能通过负向调控ZEB1,抑制人膀胱癌细胞639V增殖、侵袭及迁移,超声微泡介导是一种行之有效的转染方式。

circRNA_0051079通过靶向miR⁃26a⁃5p/PTEN轴诱导视网膜神经变性的分子机制

目的探讨circ_0051079对缺血/再灌注(I/R)损伤诱导的视网膜神经变性的影响及机制。方法从C57BL/6J乳鼠眼球中分离视网膜神经节细胞(RGC),随机分为对照组、siRNA组(转染阴性siRNA)、si_circ_0051079组(转染si⁃circ⁃0051079干扰RNA)、模拟物对照组(转染Scr mimic)、miR⁃26a⁃5p组(转染miR⁃26a⁃5p mimic)、miR⁃26a⁃5p+vector组(转染pcDNA 3.1)、miR⁃26a⁃5p+PTEN组(转染pcDNA 3.1⁃PTEN),分别在正常、缺氧(体积分数1%O_(2)暴露)或氧化应激(50μmol·L^(-1) H_(2) O_(2)暴露)条件下培养24 h,进行RT⁃qPCR、CCK⁃8、TUNEL、RNA免疫沉淀(RIP)等检测。于15只C57BL/6小鼠左眼中建立I/R损伤模型,对侧眼保持正常眼压作为对照,I/R损伤后0 d、3 d和7 d各取5只小鼠收集视网膜检测circ_0051079表达。另取20只C57BL/6小鼠分为正常对照组(用针头插入左眼前房但不升高眼压)、I/R组(左眼I/R损伤处理)、I/R+对照shRNA组(左眼注射无序shRNA并建立I/R损伤模型)、I/R+circ_0051079 shRNA组(左眼注射circ_0051079 shR⁃NA并建立I/R损伤模型)。I/R损伤后7 d,取视网膜进行蛋白免疫荧光染色。收集2020年11月至2021年3月急性闭角型青光眼和白内障患者的房水样本各20例,进行RT⁃qPCR测定。结果缺氧或氧化应激条件下培养的RGC中circ_0051079表达量较正常条件下培养的RGC增加(均为P<0.05)。在缺氧或氧化应激条件下培养,si_circ_0051079组RGC细胞活力均较siRNA组增加,RGC凋亡细胞数均减少(均为P<0.05)。荧光素酶报告基因分析和RIP检测结果表明,circ_0051079可以通过调节miR⁃26a⁃3p/PTEN信号转导进而影响RGC功能。动物实验中,I/R损伤可致视网膜组织中circ_0051079表达量升高(P<0.05)。与正常对照组(1.00±0.07)相比,I/R+circ_0051079 shRNA组小鼠视网膜中circ_0051079表达水平(0.37±0.04)下降(P<0.05),同时I/R诱导的视网膜神经变性减轻。临床研究中,与白内障患者房水样本相比,青光眼患者房水样本中circ_0051079和PTEN mRNA表达增加,miR⁃26a⁃3p表达降低(均为P<0.001)。结论circ_0051079可能是缺血性视网膜病变诊断和治疗的潜在靶点。

敲降MIR210HG通过调控miR-6838-5p/AIP5轴抑制裸鼠肺癌移植瘤生长并改善肺血管栓塞特征

目的探讨长链非编码RNA MIR210HG对肺癌移植瘤裸鼠肿瘤生长和肺血管栓塞的影响和机制。方法用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析MIR210HG在肺癌中的表达。用短发夹RNA(shRNA)构建敲降MIR210HG(shMIR210HG)的肺癌细胞系MDA-MB-231,体外CCK-8实验检测敲降MIR210HG对MDA-MB-231细胞的增殖能力的影响。生物信息学分析MIR210HG与miR-6838-5p的结合关系。荧光素酶报告基因分析微小RNA(miR)-6838-5p与萎缩素相互作用蛋白5(AIP5)的直接作用。动物实验评估敲降MIR210HG对移植瘤裸鼠体内肿瘤生长和裸鼠肺血管栓塞特征的影响。功能回复实验和蛋白免疫印迹实验分析MIR210HG通过miR-6838-5p/AIP5轴调控裸鼠体内肿瘤生长和裸鼠肺血管栓塞。结果MIR210HG在肺癌组织中高表达(P<0.05),并与低存活率呈正相关(P<0.05)。敲降MIR210HG抑制体外肺癌细胞增殖和裸鼠体内肿瘤的生长(均P<0.05),敲降MIR210HG改善裸鼠肺动脉炎性浸润,明显减少肺评分、降低裸鼠的右心室收缩压(RVSP)、血清TNF-α和IL-6的水平(均P<0.05)。生信分析预测MIR210HG与miR-6838-5p具有多个结合位点,且shMIR210HG促进miR-6838-5p的表达(均P<0.05)。AIP5被鉴定为miR-6838-5p的靶基因。此外,shMIR210HG可以明显抑制AIP5的mRNA和蛋白表达(均P<0.05),而miR-6838-5p inhibitor促进AIP5的mRNA和蛋白表达(均P<0.05)。另外,在裸鼠体内敲降MIR210HG基础上用miR-6838-5p inhibitor治疗或者AIP5的过表达质粒(AIP5-OE)治疗后裸鼠体内肿瘤的生长增加,裸鼠肺评分、RVSP、及血清TNF-α和IL-6的水平均明显增加(均P<0.05)。结论敲降MIR210HG通过调控miR-6838-5p/AIP5轴能抑制肺癌移植瘤裸鼠肿瘤生长并改善肺血管栓塞特征。