基于miR-138-5p/E2F3信号通路探讨柠檬苦素对人非小细胞肺癌H1299细胞生物学行为的影响

目的:基于微小RNA-138-5p(miR-138-5p)/E2F转录因子3(E2F3)信号通路探讨柠檬苦素对人非小细胞肺癌H1299细胞生物学行为的影响。方法:设H1299细胞组、氟尿嘧啶组(25μg·ml-1)、柠檬苦素低、高剂量组(40,80μg·ml-1),以上各组每孔设6个平行样,培养72 h。培养结束后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞活力,结晶紫染色测定单克隆形成数目,Transwell小室测定细胞侵袭迁移水平,流式细胞仪测定细胞凋亡率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹(Westernblot)法测定细胞miR-138-5p、E2F3 mRNA及蛋白水平。结果:与H1299细胞组比较,氟尿嘧啶组、柠檬苦素低、高剂量组光密度(OD)值、细胞存活率、克隆形成数目、穿膜数目、E2F3 mRNA和蛋白表达水平显著降低,凋亡率、miR-138-5p表达水平显著升高(P<0.05)。与氟尿嘧啶组比较,柠檬苦素低剂量组OD值、细胞存活率、克隆形成数目、穿膜数目、E2F3 mRNA和蛋白表达水平显著升高,凋亡率、miR-138-5p表达水平显著降低(P<0.05);柠檬苦素高剂量组OD值、细胞存活率、克隆形成数目、穿膜数目、E2F3 mRNA和蛋白表达显著降低,凋亡率、miR-138-5p表达水平显著升高(P<0.05)。柠檬苦素高、低剂量组间各指标差异有统计学意义(P<0.05)。结论:柠檬苦素能抑制人非小细胞肺癌H1299细胞增殖、侵袭迁移,促进非小细胞肺癌H1299细胞凋亡;其机制可能与柠檬苦素通过促进H1299细胞miR-138-5p表达,抑制E2F3 mRNA和蛋白表达,进而抑制miR-138-5p/E2F3通路的激活有关。

膀胱移行细胞癌E2F3、miR-17-5p、miR-20a的表达及相关性分析

目的检测E2F3、miR-17-5p、miR-20a在膀胱癌中的表达情况,分析E2F3与miR-17-5p、miR-20a之间是否存在关联性。方法荧光定量RT-PCR法检测不同病理分级膀胱移行细胞癌组织和细胞系5637、T24中miR-17-5p、miR-20a和E2F3基因的表达,Western blot检测E2F3蛋白的表达。结果与正常膀胱黏膜比较,膀胱移行细胞癌组织及5637、T24细胞系中E2F3、miR-17-5p和miR-20a均高表达(P<0.05)。E2F3表达随着病理分级的升高逐步增多,miR-20a表达随病理分级的升高有降低趋势。5637细胞系相对T24细胞系高表达E2F3(P<0.05)。结论膀胱移行细胞癌中miR-17-5p、miR-20a和E2F3均高表达,miR-20a和miR-17-5p的表达与E2F3的增高密切相关。

miR-129-3p通过E2F5下调BIM表达在结直肠癌中所起的促癌作用研究

目的探讨miR-129-3p通过E2F5下调BIM表达在结直肠癌中所起的促癌作用。方法收集郑州大学第二附属医院消化内科30例结直肠癌组织和10例癌旁组织样本,生物信息学分析miR-129-3p在样本中的表达差异。qRT-PCR评估miR-129-3p在样本中的表达情况。CCK8实验检测细胞活力。转染mimic和inhibitor改变miR-129-3p表达,探讨miRNA的生物学功能。荧光素酶报告基因检测miRNA靶基因。通过转染siRNA,抑制E2F5的表达。Western blotting检测细胞蛋白表达含量。结果miR-129-3p在结直肠癌组织样本中呈低表达。通过转染mimic和inhibitor发现,提高miR-129-3p表达可以抑制细胞活力。反之,抑制miR-129-3p促进细胞增殖。荧光素酶报告基因和Western blotting检测E2F5可作为miR-129-3p靶基因。敲除miR-129-3p靶基因E2F5同样抑制结直肠癌的增殖。结论miR-129-3p可以通过下调E2F5的表达抑制结直肠癌细胞增殖。miR-129-3p有望成为治疗结直肠癌的新靶点,我们的研究为结直肠癌的靶向治疗提供新思路。

miR-503-5p通过干扰Rb/E2F信号通路抑制膀胱癌T24和EJ细胞的增殖

目的研究微小RNA-503-5p(miR-503-5p)对膀胱癌T24细胞和EJ细胞生长的影响和机制。方法 T24细胞和EJ细胞转染miR-503-5p模拟物或阴性对照微小RNA(miR-NC)并验证转染效率,生物信息学软件预测miR-503-5p的靶基因。通过荧光实时定量PCR检测miR-503-5p靶基因E2F转录因子3(E2F3)及下游基因mRNA的表达水平,Western blot法检测视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)/E2F信号通路蛋白E2F3、细胞周期蛋白E(cyclin E)、细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、Rb和磷酸化的Rb(p-Rb)蛋白水平,流式细胞术检测膀胱癌细胞周期的变化,MTT法和平板克隆形成实验检测膀胱癌细胞的增殖能力。结果转染miR-503-5p模拟物后,膀胱癌细胞中miR-503-5p的水平显著增加。过表达miR-503-5p可明显降低膀胱癌细胞中E2F3mRNA及Rb/E2F信号通路基因的表达水平,将膀胱癌细胞周期阻滞于G0/G1期,膀胱癌细胞的增殖能力明显降低。结论过表达miR-503-5p通过干扰Rb/E2F信号通路的转导,抑制膀胱癌细胞的增殖。

miR-503-5p通过靶向调控E2F3对宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质化的影响

目的探讨miR-503-5p通过靶向调控E2F3对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质化的影响。方法将宫颈癌HeLa细胞分为对照组、mimic-NC组、miR-503-5p mimic组、E2F3组、mimic+E2F3组,并通过Lipofectamine2000将质粒分别或者联合转染进入各组HeLa细胞,运用基因预测软件预测靶基因,荧光素实验验证靶向关系,RT-PCR检测miR-503-5p和E2F3的表达,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测Ki67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、E-cadherin和N-cadherin的表达,Transwell检测细胞侵袭,划痕实验检测细胞迁移。将裸鼠分为对照组和miR-503-5p mimic组,在裸鼠右后肢腹侧皮下分别注射0.2 mL转染mimic-NC或miR-503-5p mimic的宫颈癌HeLa细胞悬液,第30天颈椎脱位法处死裸鼠,测量肿瘤质量,并用免疫组化方法检测肿瘤组织中Ki67和Vimentin表达情况。结果宫颈癌HeLa细胞中miR-503-5p的表达量明显下调,miR-503-5p与E2F3在3′UTR区存在结合位点,miR-503-5p直接靶向作用于E2F3,过表达miR-503-5p抑制E2F3表达;miR-503-5p过表达降低细胞生长速度、Ki67和PCNA表达量,减少侵袭细胞数目,增宽划痕、降低愈合率,上调E-cadherin表达、下调N-cadherin表达(P<0.01);miR-503-5p过表达减小移植瘤体积、减轻移植瘤重量,减少Ki67和Vimentin的阳性所占比率(P<0.01)。结论 miR-503-5p通过靶向调控E2F3抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质化。