miR-200b、miR-200c靶向肝细胞生长因子抑制结直肠癌细胞

目的研究miR-200b、miR-200c对肝细胞生长因子进行靶向调节抑制结直肠癌细胞增殖的机制。方法采用生物信息学软件预测和验证miR-200b、miR-200c靶基因,分析miR-200b、miR-200c过表达抑制HGF表达,并分析miR-200b、miR-200c在体外影响结直肠癌细胞增殖活性的情况。结果培养1d、2d、3d,阴性对照模拟物的结直肠癌细胞增殖活性均高于miR-200b模拟物、miR-200c模拟物、miR-200b/c模拟物(P<0.05),阴性对照抑制剂的结直肠癌细胞增殖活性均低于miR-200b抑制剂、miR-200c抑制剂、miR-200b/c抑制剂(P<0.05),miR-200b模拟物、miR-200c模拟物的结直肠癌细胞增殖活性均高于miR-200b/c模拟物(P<0.05),miR-200b抑制剂、miR-200c抑制剂的结直肠癌细胞增殖活性均低于miR-200b/c抑制剂(P<0.05)。结论miR-200b、miR-200c对肝细胞生长因子进行靶向调节抑制结直肠癌细胞增殖,可以作为潜在治疗靶点。

绵羊miR-200b启动子鉴定及其对卵泡颗粒细胞线粒体功能的影响

旨在鉴定绵羊miR-200b的启动子区并研究其对卵泡颗粒细胞线粒体功能的影响。本研究体外分离培养绵羊卵泡颗粒细胞,通过构建包含3个不同长度启动子区重组质粒,利用生物信息软件和双荧光素酶报告试验预测并鉴定绵羊miR-200b核心启动子区;利用在线工具预测转录因子NR4A1的结合位点;通过双荧光素酶报告试验和qRT-PCR检测过表达NR 4A1基因对miR-200b启动子活性和表达水平的影响;通过转染miR-200b mimic和mimic NC,分别检测颗粒细胞线粒体形态和数量、线粒体膜电位、ROS水平、ATP和线粒体呼吸链复合物Ⅰ的浓度,并检测线粒体氧化磷酸化相关基因表达水平。结果表明,miR-200b-P1(-159/+36 nt)活性最高,确定该区域为miR-200b核心启动子区;预测出核心启动子存在1个NR4A1的结合位点,且过表达NR 4A1基因显著上调miR-200b启动子活性和miR-200b的表达水平(P<0.01)。与mimic NC组相比,转染miR-200b mimic导致颗粒细胞平均光密度显著降低(P<0.01),细胞长度显著缩短(P<0.01)、线粒体膜电位下降(P<0.05)、ATP(P<0.05)和线粒体呼吸链体复合物Ⅰ(P<0.01)的浓度降低、ROS水平升高(P<0.01),同时下调ATP 6V1G1和NDUFV 1的表达(P<0.01),上调NOX 4的表达水平(P<0.01)。该研究确定了绵羊miR-200b的核心启动子区(-159/+36 nt),NR4A1正向调控miR-200b的转录,且miR-200b能够影响线粒体氧化磷酸化过程,诱导颗粒细胞线粒体损伤。该研究结果为进一步揭示miR-200b调控绵羊卵泡发育的机制提供了理论依据。

上皮性卵巢癌患者血清miR-200a、miR-200b水平变化及意义

目的 探讨上皮性卵巢癌(EOC)患者血清miR-200a和miR-200b水平变化及意义。方法 选取EOC患者80例(EOC组)、卵巢良性病变患者80例(良性对照组)、体检健康女性80例(正常对照组),采集受试者血清,采用qRT-PCR法检测miR-200a、miR-200b。比较三组血清miR-200a、miR-200b水平,分析EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平与临床病理特征的关系,采用受试者工作特征(ROC)曲线评价二者对EOC的诊断价值。对EOC患者行手术联合化疗方案进行治疗,术后随访2年,记录患者复发情况,根据miR-200a、miR-200b中位数将患者分为低水平和高水平,比较二者的复发时间。结果 EOC组血清miR-200a和miR-200b水平较良性对照组和正常对照组升高(P均<0.01)。EOC晚期、合并淋巴结转移、腹水或腹腔灌洗液检出恶细胞患者的血清miR-200a、miR-200b水平分别高于晚期、未合并淋巴结转移、腹水或腹腔灌洗液检出恶细胞患者(P均<0.05)。ROC分析显示,血清miR-200a(AUC=0.890)和miR-200b(AUC=0.912)有助于EOC的诊断。在EOC患者中,血清miR-200a(Log-Rank=4.061,P=0.044)和miR-200b(Log-Rank=5.012,P=0.025)高水平者的复发时间均短于低水平者。结论 EOC患者血清miR-200a和miR-200b水平升高,监测血清miR-200a和miR-200b水平有助于EOC的诊断和预后评估。

miR-200b和上皮-间质转化在卵巢子宫内膜异位症中的研究

目的探讨卵巢子宫内膜异位症(EMs)是否发生了上皮-间质转化(EMT)现象,以及miR-200b在EMs中的表达情况及在EMs发生发展中的作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测EMs患者异位子宫内膜(ECs)和在位子宫内膜(EUs)以及正常子宫内膜(ENs)中miR-200b的表达水平。采用Western blot法检测所有标本中Snail蛋白的表达水平。采用非参数Student t检验或方差分析(ANOVA)进行统计分析,然后进行两两多重比较。结果在不同内膜组织中,miR-200b有不同程度的表达。与ENs组织相比,ECs和EUs组织中的miR-200b表达水平明显降低。并且ECs中miR-200b表达水平较EUs组织下调。相反,与ENs组织相比,ECs和EUs组织中Snail表达量明显升高,且ECs组织中的Snail表达水平明显高于EUs组织。Pearson相关系数检验显示,miR-200b和Snail呈显著的负相关。结论在卵巢EMs中,miR-200b表达水平降低,下调的miR-200b可能通过降低对EMT转录因子Snail的抑制作用从而促进Snail的表达,从而促使EUs组织发生了EMT,增加了EMs的发病风险。

MIF激活lncRNA-ZEB1-AS1/miR-200b信号通路促进结肠癌增殖和转移作用研究

目的:探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在结肠癌中发挥的作用及其可能的调控机制。方法:qRT-PCR检测MIF在结肠癌组织和癌旁组织中的表达及其对结肠癌患者预后的影响;qRT-PCR和免疫荧光检测MIF在结肠癌细胞HCT116和正常肠上皮细胞HIEC-6中的表达;si-RNA沉默MIF在HCT116细胞中的表达,CCK-8、Transwell和细胞划痕实验观察HCT116细胞增殖和迁移能力的变化,同时检测长链非编码RNA锌指E-盒结合同源异形盒1-反义链1(lncRNA-ZEB1-AS1)表达;starBase数据库预测分析lncRNA-ZEB1-AS1和miR-200b间的关系,双荧光素酶进行验证;分别过表达lncRNA-ZEB1-AS1和沉默miR-200b后检测HCT116增殖能力变化。结果:MIF在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织;MIF在HCT116细胞中表达显著高于HIEC-6细胞。靶向沉默MIF表达后,HCT116细胞增殖和转移能力降低,且lncRNA-ZEB1-AS1表达随着MIF沉默显著降低;starBase数据库预测及双荧光素酶标记实验结果表明lncRNA-ZEB1-AS1抑制miR-200b表达,且过表达lncRNAZEB1-AS1和沉默miR-200b均可逆转沉默MIF导致的细胞增殖能力下降。结论:MIF可能通过激活ZEB1-AS1/miR-200b信号通路促进结肠癌细胞的增殖和转移。

牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

为探究微小RNA(miR-200b)与血管内皮生长因子A(VEGFA)基因之间的靶向关系,采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点,构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列,构建该靶基因的突变型重组质粒(pGL3-promoter-mut VEGFA),再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明,预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后,VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组(P<0.05),VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性,验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。

miR-200b对小鼠矽肺纤维化的抑制作用

目的探究微小RNA-200b(miR-200b)对二氧化硅(SiO_(2))诱导的小鼠矽肺纤维化的抑制作用。方法将24只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、SiO_(2)组、SiO_(2)+agomir-NC组和SiO_(2)+miR-200b agomir组,每组6只。SiO_(2)组小鼠予以气管滴注5 mg SiO_(2)悬液,SiO_(2)+miR-200b agomir组和SiO_(2)+agomir-NC组小鼠分别在造模第1天、第7天气管滴注miR-200b模拟物(miR-200b agomir)和agomir的阴性对照(agomir-NC)。造模第14天检测小鼠肺功能后将其处死,采用HE和Masson染色观察小鼠肺组织病理变化;对支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白浓度和白细胞总数进行测定,并使用ELISA试剂盒检测小鼠BALF中转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量。结果与对照组相比,SiO_(2)组和SiO_(2)+agomir-NC组小鼠肺内可见炎性细胞聚集且伴有胶原沉积,而SiO_(2)+miR-200b agomir组小鼠肺组织中炎症减轻、胶原沉积减少。与对照组相比,SiO_(2)组和SiO_(2)+agomir-NC组小鼠呼吸频率(f)加快、呼吸暂停(PAU)次数增加(P<0.05),呼气峰值时间比率(Rpef)降低(P<0.05),经过miR-200b agomir干预后,小鼠肺功能得到改善。此外,miR-200b agomir干预也可以有效缓解SiO_(2)刺激引起的小鼠BALF中总蛋白浓度、白细胞总数和TGF-β1含量的增加。结论miR-200b可以有效减缓矽肺小鼠肺功能下降,抑制小鼠矽肺纤维化的发生发展。

miR-200b对胶质瘤细胞的扩增和浸润的影响分析

目的探究miR-200b对胶质瘤病理组织细胞扩增和浸润的影响。方法培养人胶质瘤细胞,将所培养的细胞分为空白组和抑制组,空白组不做干预,抑制组转染miR-200b质粒,对两组细胞的侵袭能力、迁移能力、凋亡情况进行检测、比较。结果Transwell实验显示,miR-200b质粒转染后U251与U87细胞计数均低于空白组(P<0.05);细胞划痕实验显示,miR-200b质粒转染后U251与U87细胞其细胞划痕迁移距离更短;在U251细胞中,空白组、抑制组细胞的凋亡率分别为25.6±5.19、39.5±8.15;在U87细胞中,空白组、抑制组细胞的凋亡率分别为15.6±3.82、31.8±5.79。结论miR-200b对于胶质瘤细胞的增殖、浸润有抑制作用,并能显著促进其凋亡。

胃癌组织中miR-200a、miR-200b和miR-429的表达及临床意义

0 引言 胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，2006年中国肿瘤发病和死亡资料分析显示，无论城市还是农村，胃癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤第二位，已成为我国今后恶性肿瘤防控的重点[1]。目前，胃癌的病因尚不明确，加之滞后的临床表现和诊断，以手术为主、放化疗为辅的综合治疗手段亦未能显著提高患者的5年生存率[2]。所以，探寻胃癌新特异性的分子标志物，为其早期诊断开辟新途径具有重要意义。

miR-200b靶向DNMT3A抑制非小细胞肺癌细胞增殖与诱导凋亡

目的探讨miR-200b是否通过靶向调控DNMT3A抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖与诱导凋亡。方法运用qRT-PCR检测miR-200b在不同非小细胞肺癌细胞株中的表达;将miR-200b mimics、scramble、DNMT3A-si RNA、control-siRNA分别转染于A549细胞,其中scramble与control-siRNA分别作为miR-200b mimics与DNMT3A-siRNA的阴性对照组。采用Western blot检测A549细胞中DNMT3A蛋白表达;采用MTT与AnnexinV-FITC/PI染色法分别检测A549细胞的增殖与凋亡,比较mi R-200b mimics与DNMT3A-si RNA对A549细胞增殖与凋亡的影响。结果qRT-PCR结果显示,miR-200b在非小细胞肺癌A549、H1299、L78、H460细胞中的表达均明显低于正常人支气管上皮16HBE细胞,其中以A549细胞下调最为明显(P<0.05)。Western blot结果显示,外源过表达mi R-200b或沉默DNMT3A能明显下调A549细胞中DNMT3A蛋白的水平。MTT结果显示,转染mi R-200b mimics或沉默DN-MT3A 48h、72h、96h后,反映细胞增殖的光密度(OD)值与各自阴性对照组比较明显减小(P<0.05)。AnnexinV-FITC/PI染色结果显示,转染miR-200b mimics或沉默DNMT3A后,A549细胞的凋亡率分别为(23.33%±0.90%、20.41%±0.70%)均高于各自阴性对照组(5.28%±0.55%、5.68%±0.47%,P<0.05)。结论miR-200b通过下调DNMT3A抑制人非小细胞肺癌细胞增殖与诱导凋亡。

miR-200b对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的负性调控作用

目的研究miRNA-200b对三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。方法定量PCR检测人乳腺癌细胞株MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、SKBR3、MDA-MB-468、MDA-MB-231中miRNA-200a/b/c的表达情况,通过miR-200b抑制剂及拟似物分别抑制、促进miR-200b的表达后,观察癌细胞增殖能力、克隆形成及侵袭能力的变化。结果 miRNA-200家族在Luminal型乳腺癌细胞MCF-7、BT-474和Her-2表达型MDA-MB-453、SKBR3的表达量高于三阴性型MDA-MB-468、MDA-MB-231的表达。通过inhibitor、mimics分别抑制、促进MDA-MB-231细胞中miR-200b的表达后,结果显示miR-200b对肿瘤细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),miRNA-200b组对肿瘤细胞的克隆形成有抑制作用(P<0.05),对癌细胞侵袭有抑制作用(P<0.05)。结论miRNA-200b对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231具有负性调控作用,可以作为潜在的早期诊断及治疗靶点。

miR-200b靶向VEGF抑制肺癌细胞侵袭

目的探讨miR-200b是否通过靶向调控血管内皮生长因子(VEGF)抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭,以揭示miR-200b的抑瘤机制。方法运用qRT-PCR检测miR-200b在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达;将非小细胞肺癌A549细胞分为miR-200b mimics组、miR-200b inhibitors组、scramble组、VEGF-siRNA组和control-siRNA组,分别将miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA转染于A549细胞;采用Western blot检测A549细胞中VEGF蛋白表达,采用Transwell侵袭实验分别检测A549细胞侵袭能力。结果 qRT-PCR检测结果显示,miR-200b在A549、16HBE细胞的表达分别为0.704±0.053、1.582±0.071,两者比较,差异有显著性(P<0.01);Western blot结果显示,外源过表达miR-200b或沉默VEGF能明显下调A549细胞中VEGF蛋白的表达水平;Transwell侵袭实验显示,转染miR-200b mimics或沉默VEGF 36 h后穿过基底膜的细胞数分别为(127±6)和(136±8),与对照组(189±14)比较能明显抑制A549细胞的穿膜能力(P<0.05),而转染miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA对A549细胞的侵袭抑制作用。结论 miR-200b通过靶向调控VEGF抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭。

miR-200b对胃癌MGC-803细胞增殖的影响以及对Bcl-2表达的调节

目的:研究miR-200b对胃癌MGC-803细胞Bcl-2蛋白及mRNA表达的调节作用,探讨miR-200b对胃癌MGC-803细胞增殖的影响.方法:用人工合成的miR-200b相应的双链互补DNA片段,插入miRNASelectTM pEGP-miR载体,经测序鉴定后作为microRNA的表达质粒;用脂质体将miR-200b高表达质粒转染进MGC-803胃癌细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆.构建Bcl-2高表达质粒,转染入MGC-803胃癌细胞和含有miR-200b高表达质粒的MGC-803细胞中.用RT-PCR技术和Western blot方法分别检测Bcl-2的mRNA和蛋白表达;用MTT法检测胃癌MGC-803细胞增殖的变化.结果:Western blot结果显示,与正常MGC-803细胞相比,转染了miR-200b的胃癌MGC-803细胞中,Bcl-2蛋白的表达降低了56.91%,RT-PCR分析显示Bcl-2mRNA表达降低了32.29%;MTT结果显示转染了miR-200b的细胞增殖受到显著抑制.进一步的实验结果显示,转染了Bcl-2高表达质粒的胃癌细胞增殖受到促进,48h最明显增加了16.82%,然而转染了miR-200b和Bcl-2高表达质粒的MGC-803细胞增殖却下降了7.97%;Western blot结果显示,与转染了pCMV6-XL5-Bcl-2高表达质粒的MGC-803细胞组相比,转染了pEGP-miR-200b高表达质粒的MGC-803细胞中Bcl-2蛋白的表达降低了4.84倍,而转染了pEGP-miR-200b和pCMV6-XL5-Bcl-2高表达质粒的MGC-803细胞中Bcl-2蛋白的表达量降低了1.76倍.结论:过表达的miR-200b抑制MGC-803胃癌细胞增殖,这种抑制作用至少部分与Bcl-2基因的低表达有关.

半滑舌鳎miR-200a和miR-200b前体克隆及其免疫应答分析

为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织(肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢)中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织(肝脏、肠、脾脏和头肾)中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖(WGP)、聚肌胞苷酸(poly I:C)4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。

急性缺血性脑卒中病人血清miR-7和miR-200b表达水平及与脑侧支循环分级的关系探讨

目的检测急性缺血性脑卒中(CIS)病人血清miR-7和miR-200b表达水平,探讨二者对CIS病人脑侧支循环途径的预测价值。方法选择2016年5月—2018年5月在我院神经内科住院治疗的126例CIS病人为研究对象,根据脑侧支循环的建立情况分为一级侧支循环组(44例)、二级侧支循环组(63例)和三级侧支循环组(19例),同期选取健康体检者50名作为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测受试者血清miR-7、miR-200b水平,并进行分析。结果与对照组比较,CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。检测血清miR-7、miR-200b水平诊断CIS疾病的ROC曲线下面积(AUC)分别为:0.734、0.667,灵敏度分别为63.41%、57.89%,特异度分别为75.70%、74.61%。miR-7、miR-200b表达水平与CIS病人脑侧支循环分级和美国介入和治疗神经放射学会/介入放射学会(ASITN/SIR)血流分级有关(P<0.05)。miR-7、miR-200b水平预测CIS病人建立三级侧支循环途径的AUC分别为0.894、0.876,灵敏度分别为79.82%、71.90%,特异度分别为86.91%、84.73%。结论CIS病人血清miR-7、miR-200b低表达,且在脑侧支循环分级不同的病人存在明显差异,检测血清miR-7、miR-200b水平对CIS病人脑侧支循环途径的预测具有一定价值。

miR-200b调控肌球蛋白轻链激酶／磷酸化肌球蛋白轻链信号通路对肠上皮紧密连接的影响

目的探究mi R-200b对肠上皮紧密连接的影响及作用机制。方法利用阴性对照慢病毒及表达mi R-200b的慢病毒感染Caco-2细胞形成NC株和200b株,以10 ng/m L肿瘤坏死因子(TNF-α)处理建立体外肠上皮损伤模型,并分为NC组、NC+TNF-α组、200b组和200b+TNF-α组。测量4组细胞对肠上皮跨膜电阻抗(TEER)及对异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FITC-dextran)的通透性;Western blot检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)及磷酸化肌球蛋白轻链(P-MLC)表达。结果与NC组相比,NC+TNF-α组TEER值降低、对FITC-dextran通透量显著增高、MLCK和P-MLC表达上调,差异均有统计学意义(P?<0.05)。与NC+TNF-α组相比,200b+TNF-α组TEER显著升高、FITC-dextran通透量显著降低、MLCK和P-MLC表达显著下调,差异均有统计学意义(P?<0.05)。结论 mi R-200b可调控MLCK/P-MLC信号通路修复TNF-α导致的肠上皮紧密连接损伤。

MiR-200b通过调控PIK3CA/AKT通路抑制大鼠角膜血管新生

目的探讨microRNA-200b(miR-200b)在大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成中的作用及其调节机制。方法24只雌性SD大鼠采用一眼经缝线法构建CNV模型(实验组),另一眼作为正常对照组,于裂隙灯下观察建模后第4、7、14天角膜新生血管情况,采用HE染色观察角膜组织结构改变及炎性细胞浸润情况,RT-PCR检测造模后第14天各组大鼠角膜组织中miR-200b以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。利用脂质体转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),分为miR-200b模拟物(miR-200b mimic)组、阴性对照(miR-NC)组、空白对照(CON)组,利用RT-PCR验证转染效果,分别采用CCK-8检测HUVECs增殖能力,划痕实验检测HUVECs迁移能力,Matrigel胶成管实验检测HUVECs管腔形成能力。并通过Western blot检测VEGF及PIK3CA、AKT蛋白的表达。结果成功构建大鼠CNV模型,HE染色显示与正常组相比,缝线后第4、7、14天,大鼠角膜组织排列紊乱,炎性细胞浸润逐渐加重(P<0.05),RT-PCR结果显示缝线后第14天角膜组织中miR-200b表达明显降低,而VEGF表达明显升高(P<0.01)。与CON组和miR-NC组相比,miR-200b mimic组中miR-200b相对表达量显著升高(P<0.01),而增殖、迁移及管腔形成能力显著下降(P<0.05),转染miR-200b mimic后,HUVECs中VEGF、PIK3CA、p-AKT蛋白表达均明显下降(P<0.05)。结论miRNA-200b可显著抑制HUVECs的增殖、迁移及成管能力,可能通过抑制PIK3CA/AKT通路参与CNV的发生和发展。

miR-200b介导血肿瘤屏障通透性增加的机制

目的:研究微小RNA(microRNA,miRNA)miR-200b是否介导血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)通透性增加。方法:测量跨内皮阻抗值(TEER)、辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量,分析血脑屏障(bloodbrain barrier,BBB)和BTB通透性的改变,应用Real-time PCR检测血脑屏障BBB和BTB大鼠脑微血管内皮细胞(rat cerebral microvascular endothelial cell RCMEC,ECs)miR-200b的表达,应用miR-200b agomir和miR-200b antagomir分别转染GECs(ECs和U87脑胶质瘤细胞共培养的细胞)后分析血肿瘤屏障的通透性改变;应用Western blot检测紧密连接相关蛋白ZO-1(zonula occludens-1)的表达;应用免疫荧光方法观察GECs紧密连接相关蛋白ZO-1和丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)结构和分布的改变。结果:与BBB相比,BTB的TEER值显著降低,HRP显著升高;与BBB的ECs相比,GECs内源性miR-200b表达显著降低;miR-200b agomir和miR-200b antagomir成功转染到GECs中;miR-200b agomir组TEER值显著升高,HRP流量显著降低,以及ZO-1表达显著升高,抑制ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移,抑制丝状肌动蛋白由细胞膜边缘向细胞中央区分布,F-actin分布于细胞边缘明显增加,应力纤维形成明显减少;miR-200b antagomir结果与miR-200b agomir实验结果相反。结论:MiR-200b介导BTB通透性增加。

miR-200b调控PDCD4的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨miR-200b对乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响及其可能的分子机制。方法利用荧光实时定量PCR检测人乳腺癌组织及乳腺癌细胞株中miR-200b的表达差异;利用生物信息学方法预测miR-200b的靶基因,并使用免疫蛋白印迹实验对靶基因的表达进行验证;分别将miR-200b siRNA、PDCD4 mimics以及相应对照miRNA转染MCF-7细胞,通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果miR-200b在乳腺癌组织中呈低表达水平,进一步抑制miR-200b的表达,乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力显著增强(P<0.05);将miR-200b siRNA、PDCD43′-UTR共转染到乳腺癌MCF-7细胞中,双荧光素酶报告基因结果显示抑制miR-200b的表达后,PDCD4的表达及活性相应上调(P<0.05);同时通过蛋白免疫印迹实验可以发现,抑制miR-200b表达后,PDCD4蛋白表达含量降低,乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力明显增强(P<0.05);而过表达PDCD4后PDCD4蛋白表达含量增加(P<0.05),乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论miR-200b可靶向上调PDCD4基因的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力。

miR-200b靶向MAP2对缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响

目的研究miR-200b对缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响及潜在机制。方法将大鼠皮质神经细胞分为正常对照组(不做处理),缺氧缺糖模型组(含0.5 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle.s液培养48 h),anti-miR-NC组、anti-miR-200b组、miR-NC组和miR-200b组,qRT-PCR检测细胞中miR-200b、calpain1 m RNA和MAP2 mRNA的含量,Western blot测定MAP2、calpain1、凋亡相关蛋白pro-caspase3和cl-caspase3的水平,CCK8法和流式细胞术分别检测细胞存活率和凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-200b与MAP2的靶向关系。结果与对照组相比,缺氧缺糖模型组大鼠皮质神经元细胞中miR-200b和calpain1 mRNA水平均升高(P<0.05),MAP2 mRNA水平降低(P<0.05),细胞存活率降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);在缺氧缺糖模型组大鼠皮质神经元细胞中抑制miR-200b可提高细胞存活率(P<0.05),降低细胞凋亡率(P<0.05),提高pro-caspase3、MAP2mRNA和蛋白含量(P<0.05),降低cl-caspase3、calpain1 mRNA和蛋白含量(P<0.05),过表达miR-200b则结果相反;双荧光素酶报告实验结果表明,MAP2是miR-200b的靶点。结论miR-200b可能靶向MAP2调控缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤和凋亡。