miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

仙茅苷调节lncRNA KCNQ1OT1/miR-214-5p轴对骨质疏松大鼠骨代谢的影响王勤俭张攀张睿昕李泊泊

目的探讨仙茅苷调节长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1OT1)/miR-214-5p轴对骨质疏松大鼠骨代谢的改善作用。方法SD大鼠分为对照组、模型组、仙茅苷组、pcDNA组、pcDNA-KCNQ1OT1组、仙茅苷+sh-NC组、仙茅苷+sh-KCNQ1OT1组。ELISA法检测血清中骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平;三点弯曲实验检测股骨最大位移、最大载荷;Micro-CT检测骨微结构变化;HE染色检测股骨病理变化;qRT-PCR检测股骨中lncRNA KCNQ1OT1、miR-214-5p表达;验证lncRNA KCNQ1OT1与miR-214-5p的关系。结果与对照组比较,模型组骨小梁结构紊乱,OCN、ALP水平、股骨最大位移、最大载荷、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积分数及lncRNA KCNQ1OT1表达降低,TNF-α、IL-6水平、miR-214-5p表达升高(P<0.05);与模型组比较,仙茅苷组骨小梁排列间隙变小,OCN、ALP水平、股骨最大位移、最大载荷、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积分数及lncRNA KCNQ1OT1表达升高,TNF-α、IL-6水平、miR-214-5p表达降低(P<0.05);与pcDNA组比较,pcDNA-KCNQ1OT1组股骨组织病理损伤有所缓解,OCN、ALP水平、股骨最大位移、最大载荷、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积分数及lncRNA KCNQ1OT1表达升高,TNF-α、IL-6水平、miR-214-5p表达降低(P<0.05);sh-KCNQ1OT1逆转了仙茅苷对骨质疏松症大鼠炎症反应及骨生物力学性能的改善作用以及成骨促进作用;lncRNA KCNQ1OT1靶向调控miR-214-5p。结论仙茅苷可能通过调控lncRNA KCNQ1OT1/miR-214-5p轴改善骨质疏松症大鼠骨代谢。

小儿急性复杂性阑尾炎血清lncRNA-DANCR、miR-214-5p水平及其诊断价值

目的 分析血清长链非编码RNA(lncRNA)-分化拮抗非蛋白编码RNA(DANCR)和miR-214-5p对小儿急性复杂性阑尾炎的诊断价值。方法 本研究选取2019年1月—2022年1月宝鸡市中医医院收治的急性阑尾炎患儿102例作为研究组,根据病理结果分为单纯性阑尾炎组和复杂性阑尾炎组,另选同期本院健康体检儿童50例作为对照组;实时荧光定量PCR检测血清lncRNA-DANCR和miR-214-5p水平;采用全自动化学发光免疫分析仪检测C反应蛋白(CRP)以及降钙素原(PCT);Pearson法分析血清lncRNA-DANCR和miR-214-5p以及二者与CRP、PCT的相关性;Logistic回归分析小儿急性复杂性阑尾炎的影响因素;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA-DANCR、miR-214-5p、CRP和PCT水平对小儿急性复杂性阑尾炎的诊断价值。结果 复杂性阑尾炎组和单纯性阑尾炎组血清lncRNA-DANCR、CRP和PCT水平显著升高(P<0.05),复杂性阑尾炎组和单纯性阑尾炎组血清miR-214-5p显著降低(P<0.05)。Pearson相关性分析血清lncRNA-DANCR和miR-214-5p呈负相关(P<0.05),血清lncRNA-DANCR与CRP和PCT呈正相关(P<0.05),miR-214-5p与CRP和PCT呈负相关(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,lncRNA-DANCR、CRP和PCT高表达和miR-214-5p低表达是影响小儿急性复杂性阑尾炎的危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析四者联合优于lncRNA-DANCR和miR-214-5p各自单独诊断(Z_(联合vs. lncRNA-DANCR=2.647)、Z_(联合vs. miR-214-5p=4.256)、Z_(联合vs. CRP=3.245)、Z_(联合vs. PCT=3.267),均P<0.05)。结论 在急性复杂性阑尾炎患儿血清中lncRNA-DANCR高表达,miR-214-5p低表达,二者联合可诊断小儿急性复杂性阑尾炎。

miR-214-5p调控MFG-E8表达参与主动脉瓣膜间质细胞成骨样分化

目的研究乳脂球表皮生长因子8(milk fat globule-epidermal growth factor 8,MFG-E8)对主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)成骨样分化的影响,并寻找调控其表达的微小RNA(microRNA,miRNA),探讨其在钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)发病机制中的作用。方法收集因CAVD行主动脉瓣置换手术患者的钙化瓣膜标本及因扩张型心肌病行心脏移植手术患者的非钙化瓣膜标本,通过免疫组织化学染色及Western blot实验检测MFG-E8在钙化瓣膜及非钙化瓣膜中的表达;分离AVICs进行体外培养,通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默MFG-E8及成骨培养液(osteogenic medium,OM)干预,研究MFG-E8在AVICs成骨样分化中的作用;TargetScanHuman网站预测调控MFG-E8表达的miRNA并对其功能进行检测;real-time PCR检测miRNA在钙化及非钙化瓣膜中的表达差异。结果与非钙化瓣膜相比,钙化瓣膜中MFG-E8表达显著上调;以siRNA沉默MFG-E8显著抑制了OM诱导的AVICs成骨样分化;miR-214-5p可影响MFG-E8表达从而调控AVICs成骨样分化;相较于非钙化瓣膜,钙化瓣膜中miR-214-5p表达显著下调。结论miR-214-5p通过调控MFG-E8表达参与主动脉瓣膜间质细胞成骨样分化,在CAVD发病机制中可能发挥重要作用。

LINC00963通过miR-214-5p/SEMA4C调控结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨基因间长链非编码RNA00963(LINC00963)对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法:通过LncBase Predicted v.2预测LINC00963和miR-214-5p的调控关系并通过双荧光素酶实验进行验证,StarBase v3.0预测LINC00963和SEMA4C相关性。常规培养结直肠癌细胞系HCT116、SW480,将结直肠癌细胞分为si-nc组、si-LINC00963组、miR-nc组、miR-214-5p mimic组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测LINC00963、miR-214-5p和SEMA4C的表达水平,细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖,划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。Western blot法检测细胞中SEMA4C蛋白表达水平。结果:通过LncBase Predicted v.2预测发现LINC00963和miR-214-5p存在结合位点,StarBase v3.0显示LINC00963和SEMA4C呈正相关,双荧光素酶报告实验显示LINC00963与miR-214-5p存在相互作用。在HCT116、SW480细胞转染24 h后,与si-nc组比较,si-LINC00963组结直肠癌细胞增殖活力、划痕愈合力和侵袭细胞的数量均减弱,细胞中miR-214-5p表达增高,SEMA4C的mRNA和蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);将miR-214-5p mimic同样转染至HCT116、SW480细胞24 h后,与miR-nc组比较,miR-214-5p mimic组miR-214-5p表达增高,SEMA4C的mRNA和蛋白表达水平显著下降,结直肠癌细胞增殖活力、划痕愈合力和侵袭细胞的数量均减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LINC00963在结直肠癌中呈现高表达,下调其表达可增加miR-214-5p的表达,降低SEMA4C的表达,从而抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。

miR-214-5p靶向FGFRL1对甲状腺癌细胞TPC-1增殖、侵袭和迁移影响

目的探讨微小RNA-214-5p(miR-214-5p)靶向成纤维细胞生长因子受体样1(FGFRL1)调控甲状腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制。方法2019年1~5月收集来自榆林市第一医院的47例甲状腺癌患者的癌组织及其癌旁组织,体外培养甲状腺癌BCPAP、TPC-1、SW1736细胞和正常甲状腺HT-ori3细胞,采用qRT-PCR法检测miR-214-5p与FGFRL1的表达;免疫组化检测甲状腺癌组织中FGFRL1阳性率;miR-214-5p模拟物/抑制剂(mi R-214-5p mimics/anti-miR-214-5p)及阴性对照(mi R-con/anti-miR-con)、FGFRL1小干扰RNA(si-FGFRL1)及其阴性对照(si-con)、miR-214-5p mimics与pcDNA-con、miR-214-5p mimics与FGFRL1过表达载体(pcDNA-FGFRL1)转染至TPC-1细胞;采用甲基噻唑基四唑(MTT)与Transwell迁移及侵袭实验分别检测miR-214-5p、FGFRL1对TPC-1细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。双荧光素酶报告基因实验验证miR-214-5p与FGFRL1的关系。结果与癌旁组织比较,甲状腺癌组织中miR-214-5p的表达量降低,FGFRL1的表达量升高,FGFRL1阳性率升高,差异均有统计学意义(P<0.05);甲状腺癌细胞中miR-214-5p表达水平低于正常甲状腺细胞,而FGFRL1表达水平高于正常甲状腺细胞,差异均有统计学意义(P<0.05);转染miR-214-5p mimics后,TPC-1细胞存活率降低,迁移及侵袭细胞数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);转染anti-miR-214-5p后,TPC-1细胞存活率升高,迁移及侵袭细胞数增多,差异均有统计学意义(P<0.05);敲减FGFRL1可明显抑制TPC-1细胞增殖、迁移及侵袭,差异均有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证明miR-214-5可靶向结合FGFRL1;FGFRL1过表达可逆转上调miR-214-5p表达对TPC-1细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论miR-214-5p通过靶向FGFRL1而减弱甲状腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

hsa-miR-214-5p通过下调PAK4对子宫颈癌HeLa细胞活力和凋亡的调控作用

目的:探究微小RNA-214-5p(micro RNA-214-5p、miR-214-5p)对宫颈癌HeLa细胞生长和凋亡的作用及机制。方法:将细胞分为HeLa组、mimic-scramble组、miR-214 mimic组和miR-214 inhibitor组,用miR-214 mimic和miR-214 inhibitor转染细胞,qRT-PCR检测miR-214和p21活化激酶4(P21-activated kinases 4, PAK4)的表达;生物信息学方法预测miR-214-5p与PAK4的关系,荧光素酶报告实验验证miR-214-5p与PAK4的关系;用pcDNA-PAK4(pc-PAK4)、miR-214 mimic和miR-214 inhibitor转染细胞,Western blot检测PAK4的表达;CCK-8检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:miR-214 mimic组miR-214-5p mRNA的表达水平(46.02±5.23)较HeLa组(1.00±0.01)明显升高(LSD-t=31.423,P=0.000),miR-214 mimic组PAK4蛋白的表达水平(0.08±0.04)较HeLa组(0.26±0.05)明显降低(LSD-t=4.296,P=0.002);miR-214 inhibitor组miR-214-5p mRNA的表达水平(0.41±0.05)较HeLa组(1.00±0.01)明显降低(LSD-t=18.726,P=0.000),miR-214 inhibitor组PAK4蛋白的表达水平(0.58±0.05)较HeLa组(0.26±0.05)明显升高(LSD-t=5.061,P=0.001);miR-214-5p与PAK4可靶向结合。miR-214 mimic组细胞生长速度(3.50±0.45)较HeLa组(5.02±0.35)明显降低(tD=8.644,P=0.000),miR-214 mimic组细胞凋亡率[(11.42±0.71)%]较HeLa组[(2.61±0.63)%]明显升高(LSD-t=4.032,P=0.003);miR-214 inhibitor组细胞生长速度(5.89±0.32)较HeLa组(5.02±0.35)明显升高(LSD-t=7.863,P=0.000),miR-214 inhibitor组细胞凋亡率[(0.53±0.42)%]较HeLa组[(2.61±0.63)%]明显降低(LSD-t=4.221,P=0.002);共转染pc-PAK4能逆转miR-214 mimic对细胞活力和细胞凋亡的调控作用。结论:miR-214-5p能通过靶向下调PAK4抑制宫颈癌HeLa细胞活力并诱导细胞凋亡。

miR-214-5p通过调控SFRP2影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡

目的研究人瘢痕疙瘩形成过程中微小RNA-214-5p(miR-214-5p)与分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)2对成纤维细胞增殖及凋亡的影响并分析可能作用机制。方法分离培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)与正常皮肤成纤维细胞(NFB),miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC分别转染KFB细胞,应用qRT-PCR与Western印迹分别检测miR-214-5p、SFRP2 mRNA及蛋白表达变化。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法与流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡。采用双荧光素酶报告实验检测miR-214-5p是否可调控SFRP2基因。结果 KFB细胞中miR-214-5p表达水平显著低于NFB细胞(P<0.05),而SFRP2 mRNA与蛋白表达水平显著高于NFB组(P<0.05)。miR-214-5p组KFB细胞增殖活力明显低于miR-NC组(P<0.05),与miR-NC组相比,miR-214-5p组CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而p21、p27蛋白表达水平显著升高(P<0.05),转染miR-214-5p mimic后KFB细胞凋亡率显著高于miR-NC组(P<0.05),Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05),而Bax、酶切caspase-3表达水平均显著升高(P<0.05),SFRP2与miR-214-5p存在结合位点,共转染miR-214-5p mimic与WT-SFRP2野生型质粒的KFB细胞相对荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC与WT-SFRP2野生型质粒的KFB细胞(P<0.05),表明miR-214-5p可与SFRP2基因的3′UTR结合而调控其活性。miR-214-5p组SFRP2蛋白(0.17±0.03)显著低于miR-NC组(0.58±0.05,P<0.05);anti-miR-214-5p组SFRP2蛋白(0.92±0.08)显著高于anti-miR-NC组(0.59±0.06,P<0.05)。相较于si-NC组,转染si-SFRP2可显著抑制细胞增殖及显著促进细胞凋亡,共转染miR-214-5p mimic与pcDNA-SFRP2后细胞增殖活力显著高于miR-214-5p+pcDNA组(P<0.05),与miR-214-5p+pcDNA组比较,miR-214-5p+pcDNA-SFRP2组细胞凋亡能力显著降低(P<0.05)。结论 miR-214-5p负向调控SFRP2表达并通过影响细胞增殖及凋亡蛋白表达进而抑制KFB增殖并促进细胞凋亡。

miR-214-5p调控HOXA13抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化

目的探讨miR-214-5p通过调节同源盒蛋白(HOXA)13表达抑制高糖诱导的HMC细胞炎症反应和纤维化的作用机制。方法采用RT-qPCR检测高糖干预的HMC细胞中miR-214-5p、细胞间黏附分子(ICAM)-1、骨形态发生蛋白(BMP)-7和纤维连接蛋白(FN)表达。将miR-214-5p抑制剂(inhibitors)转染至HMC细胞后以30 mmol/L D-葡萄糖处理细胞,Western印迹检测细胞中ICAM-1、BMP-7和FN蛋白表达。采用Targetscan在线预测、双荧光素酶报告基因实验和Western印迹实验验证miR-214-5p与HOXA13的靶向关系。Western印迹检测过表达HOXA13对HMC细胞中ICAM-1、BMP-7和FN蛋白表达的影响。共转染miR-214-5p inhibitors和HOXA13 siRNA,检测细胞中TGF-β1蛋白表达。结果与5 mmol/L D-葡萄糖干预的HMC细胞相比,高糖诱导的细胞中miR-214-5p mRNA、ICAM-1和FN蛋白表达上调、BMP-7蛋白表达下调。在HMC细胞中抑制miR-214-5p或过表达HOXA13细胞中miR-214-5p mRNA、ICAM-1和FN蛋白表达水平降低而BMP-7蛋白表达水平升高。Targetscan在线预测、双荧光素酶报告基因实验和Western印迹实验结果显示,miR-214-5p能够靶向调控HOXA13蛋白表达。在高糖诱导的HMC细胞中抑制HOXA13表达可逆转miR-214-5p对TGF-β1蛋白表达的抑制作用。结论miR-214-5p能够通过靶向HOXA13调节相关蛋白表达,抑制高糖诱导的HMC细胞炎症反应和纤维化。

miR-214-5p靶向SEMA4C基因调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和侵袭的分子机制

目的研究miR-214-5p对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(RA-FLSs)增殖和侵袭的影响和潜在的分子机制。方法根据转染物将RA-FLSs细胞分为miR-NC组、miR-214-5p组、si-NC组、si-SEMA4C组、anti-miR-NC组、anti-miR-214-5p组、miR-214-5p+pcDNA-NC组和miR-214-5p+pcDNA-SEMA4C组。qRT-PCR检测RA-FLSs中SEMA4C mRNA和miR-214-5p的表达,Western Blot检测SEMA4C、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,CCK8法和Transwell实验分别测定RA-FLSs细胞增殖率和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证miR-214-5p与SEMA4C间的调控关系。结果与control组比较,在RA-FLSs细胞中miR-214-5p的表达量显著下降(P<0.05),而SEMA4C mRNA和蛋白的表达量显著升高(P<0.05);与对照miR-NC和si-NC组比较,miR-214-5p组和si-SEMA4C组RA-FLSs细胞的增殖率和侵袭细胞数均下降,CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告系统结果显示,miR-214-5p靶向负调控SEMA4C蛋白表达;与miR-214-5p+pcDNA-NC组比较,miR-214-5p+pcDNA-SEMA4C组RA-FLSs细胞增殖率和侵袭细胞数均升高,CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-214-5p通过靶向SEMA4C基因调控RA-FLSs细胞增殖和侵袭,miR-214-5p有望成为类风湿性关节炎分子诊断和治疗的靶点。

IFN-α调控miR-214-5p/MFGE8通路对人脑血管外膜成纤维细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨干扰素α(IFN-α)调控miR-214-5p/乳脂肪球表皮生长因子8(MFGE8)通路对人脑血管外膜成纤维细胞(HBVAFs)增殖、凋亡的影响。方法将HBVAFs细胞分为NC组、IFN-α组、IFN-α+anti-miR-con组、IFN-α+anti-miR-214-5p组、IFN-α+pcDNA组、IFN-α+pcDNA-MFGE8组、IFN-α+anti-miR-214-5p+si-con组和IFN-α+anti-miR-214-5p+si-MFGE8组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-214-5p和MFGE8 mRNA的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印记(Western blot)法检测MFGE8、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和Western blot法验证miR-214-5p和MFGE8的靶向调控关系。结果与NC组比较,IFN-α组HBVAFs细胞miR-214-5p的表达显著升高,MFGE8和Bcl-2的表达显著降低,Cleaved caspase-3和Bax的表达显著升高,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与IFN-α+anti-miR-con组比较,IFN-α+anti-miR-214-5p组HBVAFs细胞miR-214-5p、Cleaved caspase-3和Bax的表达显著降低,Bcl-2表达显著升高,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。miR-214-5p靶向负性调控MFGE8表达。与IFN-α+pcDNA组比较,IFN-α+pcDNA-MFGE8组HBVAFs细胞Cleaved caspase-3和Bax的表达显著降低,MFGE8和Bcl-2表达显著升高,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与IFN-α+anti-miR-214-5p+si-con组比较,IFN-α+anti-miR-214-5p+si-MFGE8组HBVAFs细胞Cleaved caspase-3和Bax的表达显著升高,MFGE8和Bcl-2表达显著降低,细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论IFN-α通过调控miR-214-5p/MFGE8通路抑制人脑血管外膜成纤维细胞增殖并促进细胞凋亡。

沉默LncRNA TUG1通过上调miR-214-5p表达增加乳腺癌细胞的放射敏感性

目的:探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(LncRNA TUG1)对乳腺癌细胞放射敏感性的影响并探究其可能作用机制。方法:选取2015年4月至2016年3月于本院就诊的45例乳腺癌患者为研究对象,根据放疗后病灶变化情况分为放射敏感组(25例)与放射抵抗组(20例),qRT-PCR检测两组患者乳腺癌组织中TUG1表达水平。构建放射抵抗的乳腺癌细胞MCF-7R,通过不同剂量X射线照射MCF-7R细胞与乳腺癌MCF-7细胞,qRT-PCR检测MCF-7R、MCF-7细胞及人乳腺上皮细胞MCF-10A中TUG1的表达量。实验将MCF-7R细胞分为沉默TUG1组、沉默对照组、过表达miR-214-5p组、过表达miR-NC组、沉默TUG1+抑制miR-NC组、沉默TUG1+抑制miR-214-5p组。双荧光素酶报告实验验证TUG1与miR-214-5p的靶向作用关系。细胞克隆实验检测各组MCF-7R细胞存活率的影响;流式细胞术实验检测各组MCF-7R细胞的凋亡率。结果:TUG1在MCF-7R细胞中的表达水平较MCF-10A、MCF-7细胞明显升高;沉默TUG1表达可降低MCF-7R细胞存活,促进细胞凋亡;TUG1可负向调控miR-214-5p表达;miR-214-5p在MCF-7R细胞中的表达水平较MCF-10A、MCF-7细胞明显降低,miR-214-5p过表达可减少MCF-7R细胞存活分数,促进放射诱导的乳腺癌细胞凋亡;但抑制miR-214-5p表达可增加MCF-7R细胞存活分数,抑制细胞凋亡。结论:沉默TUG1可通过上调miR-214-5p表达进而增加乳腺癌细胞的放射敏感性。

依托咪酯调控circ-CCND1/miR-214-5p分子轴减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

目的:探讨依托咪酯对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤的影响及其对环状RNA-CCND1(circ-CCND1)/微小RNA-214-5p(miR-214-5p)分子轴的调控作用。方法:体外培养大鼠心肌细胞H9C2,使用H/R处理细胞建立细胞损伤模型,分别加入不同浓度的依托咪酯处理H9C2细胞,分别将si-NC、si-circ-CCND1转染至H9C2细胞进行H/R处理,后续实验中分别将pcDNA、pcDNA-circ-CCND1转染至H9C2细胞,使用依托咪酯处理后进行H/R处理;根据试剂盒说明书检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性与乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)的水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;采用qRT-PCR检测circ-CCND1、miR-214-5p的表达量;双荧光素酶报告实验检测circ-CCND1、miR-214-5p的靶向关系;Western blot法检测微管相关蛋白轻链3II(LC3-Ⅱ)、微管相关蛋白轻链3Ⅰ(LC3-Ⅰ)、自噬相关基因Beclin-1蛋白表达量并计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。结果:H/R诱导的H9C2细胞中LDH、MDA的水平与凋亡率及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白水平显著升高(P<0.05),SOD、CAT的活性降低(P<0.05),circ-CCND1的表达水平显著升高(P<0.05),miR-214-5p的表达水平显著降低(P<0.05),而依托咪酯能够明显逆转H/R对H9C2细胞氧化应激、凋亡、自噬及circ-CCND1、miR-214-5p表达量的影响(P<0.05);circ-CCND1可靶向结合miR-214-5p;转染si-circ-CCND1可明显降低LDH、MDA的水平与凋亡率及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白水平(P<0.05),提高SOD、CAT的活性(P<0.05);转染pcDNA-circ-CCND1可明显降低依托咪酯对H/R诱导的H9C2细胞氧化应激、凋亡及自噬的作用(P<0.05)。结论:依托咪酯可通过下调circ-CCND1表达、上调miR-214-5p表达从而抑制H/R诱导的心肌细胞氧化应激、凋亡及自噬,进而减轻心肌细胞损伤。

miR-214-5p通过靶向调控PTEN的表达对破骨分化和骨质疏松的影响

目的探讨miR-214-5p通过靶向调控PTEN的表达对破骨分化和骨质疏松的影响。方法选取2019-03至2020-05在空军军医大学唐都医院外科进行脊柱手术的骨质疏松患者20例(骨质疏松组),同时选取非骨质疏松症患者20例为对照组,抽取两组骨髓血。将miR-214-5pmimics(miR-214-5pmimics组)、miR-214-5p空质粒(miR-214-5pvector组)、shZFAS1载体(sh PTEN组)、shZFAS1空载体(sh vector组)转染到骨质疏松患者细胞,对照组细胞不进行任何转染处理。采用RT-qPCR检测骨髓单个核细胞中的miR-214-5p和PTEN mRNA及Raw264.7单核巨噬细胞中NFaTc1、MMP9、TRAP、CTSK的mRNA水平;通过TRAP染色检测TRAP染色的阳性率;通过Western blot检测PTEN、NFATc1、AKT和PI3K蛋白水平。结果骨质疏松组miR-214-5p水平的表达明显高于对照组(P<0.001),骨质疏松组PTEN的表达显著低于对照组(P=0.009);miR-214-5pmimics组中TRAP表达阳性率明显高于对照组和miR-214-5p vector组(P<0.001);sh PTEN组中TRAP表达阳性率明显高于对照组和sh vector组(P<0.001);miR-214-5p mimics组中的NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平显著高于对照组(P<0.001);sh PTEN组中的NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平显著高于对照组(P<0.001);与miR-214-5p mimics组相比,miR-214-5pmimics+PTEN组中TRAP表达阳性率显著降低(P<0.001)。结论骨质疏松症患者的骨髓单个核细胞中miR-214-5p表达上调,miR-214-5p可以调控PTEN表达,过表达miR-214-5p可能通过靶向PTEN促进破骨细胞分化。

miR-214-5p靶向SIRT2介导白细胞介素-1β诱导软骨细胞损伤的机制研究

目的探讨微小RNA-214-5p(miR-214-5p)对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞损伤的影响及其分子机制。方法分离培养SD大鼠关节软骨细胞,用IL-1β处理细胞,采用qRT-PCR与Western blot检测miR-214-5p与SIRT2表达。软骨细胞分别转染anti-miR-214-5p、pcDNA-SIRT2,检测IL-1β诱导后细胞中miR-214-5p与SIRT2表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡。利用生物信息学预测miR-214-5p的靶基因,应用双荧光素酶报告实验及Western blot方法对靶基因进行验证。将si-SIRT2转染软骨细胞,检测IL-1β诱导后软骨细胞凋亡率。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量;采用Western blot检测细胞中Bax、Bcl-2表达。结果IL-1β处理软骨细胞后,细胞中miR-214-5p表达水平升高,SIRT2表达水平降低;IL-1β处理后的软骨细胞凋亡增多,IL-6、TNF-α、IFN-γ含量与Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低;抑制miR-214-5p表达或SIRT2过表达的软骨细胞经IL-1β诱导后,细胞凋亡率降低,IL-6、TNF-α、IFN-γ含量与Bax蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高;miR-214-5p过表达可抑制含miR-214-5p结合位点荧光报告载体的强度,将结合位点突变后抑制作用消失;抑制SIRT2表达可逆转抑制miR-214-5p表达对IL-1β诱导软骨细胞损伤的保护作用。结论抑制miR-214-5p表达可靶向SIRT2对IL-1β诱导的软骨细胞损伤发挥保护作用,其作用机制与减少软骨细胞凋亡及抑制炎性反应有关。

miR-214-5p靶向PAK4对缺血再灌注大鼠的心肌损伤和免疫反应的调节作用

目的:探讨微小RNA-214-5p(miR-214-5p)靶向p21活化蛋白激酶4(PAK4)对缺血再灌注(I/R)大鼠的心肌损伤和免疫反应的作用。方法:将健康雄性SD大鼠随机分为假手术(sham)组、I/R组、Ad-Scramble组和Ad-miR-214组(n=9)。在大鼠左心室前壁6个不同的位点注入腺病毒;4 d后,缝合左前部下行冠状动脉构建I/R模型。RT-qPCR检测miR-214的表达水平,HE染色观察心肌损伤,ELISA检测心肌损伤标志物(CK-MB、Mb和cTnI)和炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,试剂盒检测MDA含量和SOD活性,基因软件预测靶基因并通过双萤光素酶报告验证,Western blot检测caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、PAK4、p-Akt和p-mTOR表达水平。结果:miR-214在I/R大鼠心肌细胞中低表达(P<0.01);miR-214-5p过表达减轻I/R大鼠心肌损伤程度,下调CK-MB、Mb和cTnI表达,降低心肌细胞凋亡率,上调Bcl-2表达,下调Bax、caspase-3和caspase-9表达,提高SOD活性,降低MDA、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量(P<0.01);miR-214-5p与PAK4在3’-UTR存在结合位点,miR-214-5p过表达上调PAK4、p-Akt和p-mTOR表达(P<0.01)。结论:miR-214-5p过表达靶向PAK4减轻I/R大鼠的心肌损伤,并抑制心肌细胞凋亡、氧化应激反应和炎症反应,同时激活PI3K/Akt/mTOR通路。

新风胶囊抑制软骨细胞炎症和细胞外基质降解:基于调控miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴

目的探讨新风胶囊(XFC)对白介素(IL)-1β诱导的软骨细胞功能的影响及作用机制。方法构建IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型;SD大鼠灌胃制备XFC含药血清。细胞增殖实验(CCK-8)和流式细胞术筛选最佳XFC含药血清浓度;双荧光素酶报告分析miR-502-5p和TRAF2的靶向关系。构建miR-502-5p抑制表达质粒(inhibitor)及阴性对照组,转染至软骨细胞中。分为对照组(NC),IL-1β组,XFC组,IL-1β+NC-inhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor+XFC最佳含药血清组,酶联免疫吸附试验(ELASA)检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-10的水平。逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹实验(WB)、免疫荧光法检测Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、软骨蛋白聚糖抗体(ADAMTS5)和miR-502-5p/TRAF2/NF-κB基因的表达。结果与NC组相比,IL-1β组中软骨细胞活力下降,细胞凋亡率升高,且miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降,IL-1β、TNF-α和ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高(P<0.05)。筛选得出20%XFC为最佳含药血清浓度。与IL-1β组相比,XFC含药血清干预后,软骨细胞活力升高,细胞凋亡率下降,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κBp65表达下降,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达升高(P<0.05)。与NC-inhibitor相比,转染miR-502-5p inhibitor后,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降;与miR-502-5pinhibitor相比,将miR-502-5pinhibitor转染的软骨细胞和最佳XFC含药血清共培养后,XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态对软骨细胞炎症和ECM的影响。结论XFC抑制软骨细胞炎症、细胞外基质降解,减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤,其机制可能是通过调节miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴。

circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴调控铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移

目的探索circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴对铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移的影响机制。方法检测circ0000799在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达。沉默亲代三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和子代脑转移细胞MDA-MB-231-BM中circ0000799的表达。比较各组细胞生长、侵袭能力、脑转移结节数目。使用双荧光素酶报告基因实验验证circ0000799、miR-1287-5p、GPX4调控关系。检测circ0000799对铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)表达和总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比的影响。结果与人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)或癌旁组织比较,circ0000799在三阴乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中上调,且在子代三阴乳腺癌细胞系及脑转移灶中上调最为显著(P<0.05)。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组细胞生长、侵袭能力降低(P<0.05)。sh-circCTR组、sh-circ0000799组、sh-circ0000799+RSL3组脑转移结节数量依次降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,circ0000799可与miR-1287-5p相互作用,miR-1287-5p可与GPX4相互作用。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组miR-1287-5表达增加,总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比和GPX4表达降低(P<0.05)。与miR-CTR组比较,miR-1287-5p组GPX4 mRNA表达降低(P<0.05)。结论circ0000799在三阴乳腺癌中高表达且可能通过miR-1287-5p/GPX4轴促进三阴乳腺癌脑转移。

hsa-circ-002179靶向miR-143-3p调控自噬-凋亡平衡在胃癌5-氟尿嘧啶化疗耐药性中的作用研究

目的探究hsa-circ-002179靶向miR-143-3p调控自噬-凋亡平衡对胃癌的5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗耐药性的影响。方法通过5-Fu处理AGS细胞构建5-Fu耐药细胞模型(AGS/5-Fu),采用CCK8法检测5-Fu对AGS和AGS/5-Fu细胞活性的影响,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中hsa-circ-002179和miR-143-3p的表达;通过流式细胞术和Western blot分别检测细胞凋亡水平与自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和p62的表达。同时,通过软件预测hsa-circ-002179与miR-143-3p的结合位点,并采用RIP和双荧光素酶实验验证其结合作用。结果与对照组比较,耐药组的细胞活性[(172.33±9.53)%比(106.00±6.16)%,P<0.01]和自噬水平升高、凋亡率(20.5%比43.8%,P<0.01)降低,hsa-circ-002179表达升高[(4.46±0.34)比(1.05±0.66),P<0.01];转染si-002179后,耐药细胞活性降低[(80.00±2.45)%比(102.67±7.13)%,P<0.05],而凋亡水平升高(31.3%比21.8%,P<0.05)。RIP和双荧光素酶报告实验证实hsa-circ-002179与miR-143-3p直接结合,且与对照组比较,耐药细胞中miR-143-3p的表达降低[(0.38±0.05)比(1.04±0.07),P<0.01]。并且,hsa-circ-002179能够调控miR-143-3p的水平。同时,miR-143-3p抑制剂处理能够升高转染si-002179后的耐药细胞自噬水平。自噬抑制剂处理降低了耐药细胞的自噬水平和细胞活性,升高凋亡水平;在此基础上转染OE-002179则升高自噬水平和细胞活性,降低凋亡水平,进一步转染miR-143-3p模拟物可以逆转以上变化。结论hsa-circ-002179靶向miR-143-3p可能可以调控自噬-凋亡平衡,进而影响胃癌细胞的5-Fu化疗耐药性。

lncRNA TUG1靶向调节miR-31-5p对急性胰腺炎小鼠炎症反应的影响

目的:探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)在急性胰腺炎(AP)中的作用机制。方法:体外培养小鼠胰腺腺泡细胞系(MPC-83),用脂多糖(LPS,10μg/ml)和雨蛙素(Caerulein,100 nmol/L)处理3 h,建立AP模型。实验分为对照组(control组)、AP组、AP+sh-NC组、AP+sh-TUG1组、AP+sh-TUG1+inhibitor-NC组、AP+sh-TUG1+miR-31-5p inhibitor组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA TUG1和miR-31-5p之间的靶向关系。构建AP小鼠模型,给予相应的干预后,qRT-PCR检测胰腺组织中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;试剂盒检测血清中炎症因子IL-1β、TNF-α含量和淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)活性;HE染色观察胰腺组织病理学变化;TUNEL检测胰腺组织中细胞凋亡。结果:在Caerulein和LPS共同处理的MPC-83细胞中lncRNA TUG1水平、细胞凋亡率、IL-1β和TNF-α水平升高,miR-31-5p水平、细胞活力降低(均P<0.05);敲低lncRNA TUG1可上调miR-31-5p,增加细胞活力,降低IL-1β和TNF-α水平,抑制细胞凋亡(均P<0.05);下调miR-31-5p表达可减弱敲低lncRNA TUG1对细胞炎症反应的抑制作用。miR-31-5p是lncRNA TUG1的直接靶标。在体内敲低lncRNA TUG1表达可上调AP小鼠胰腺组织中miR-31-5p表达,降低IL-1β、TNF-α水平,减少细胞凋亡,改善胰腺组织损伤。结论:敲低lncRNA TUG1可能通过上调miR-31-5p表达水平,抑制炎症反应,改善AP。