miR-22-3p靶向GSDMD抑制同型半胱氨酸诱导的平滑肌细胞焦亡

目的探讨miR-22-3p对同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管平滑肌细胞焦亡的影响。方法体外培养人血管平滑肌细胞(VSMC),分为Control组(0μmol/L Hcy)与Hcy组(100μmol/L Hcy),Western blot检测细胞中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平,qRT-PCR检测miR-22-3p表达情况;ELISA检测上清中IL-1β、IL-18的浓度。转染miR-22-3p对照(miR-22-3p-NC)、miR-22-3p的模拟物(miR-22-3p-mimic)及抑制物(miR-22-3p-inhibitor)后观察Hcy诱导下VSMC的变化。结果与Control组相比,Hcy组VSMC中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平增加(P<0.05),IL-1β、IL-18浓度更高(P<0.01),miR-22-3p相对表达水平低(P<0.01);转染miR-22-3p-mimic后,VSMC中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平显著降低(P<0.01),IL-1β、IL-18浓度降低(P<0.01);转染miR-22-3p-inhibitor后VSMC中pro Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、NLRP3表达水平显著增加(P<0.01),IL-1β、IL-18浓度升高(P<0.05)。结论miR-22-3p可抑制Hcy诱导的VSMC焦亡。

牦牛KSR2基因的双荧光素酶质粒构建及其与bta-miR-22-3p的靶向验证

为了鉴定牦牛体内bta-miR-22-3p与KSR2之间的靶向关系,本研究采用miRNA Base数据库对牦牛体内bta-miR-22-3p的序列进行分析,并用Target scan软件预测牦牛bta-miR-22-3p于KSR2基因的3’UT R可能存在的结合位点,然后采用PCR扩增出包含bta-miR-22-3p结合位点的牦牛KSR2基因3'非编码区(3’UTR)片段,并构建出KSR2基因的3’UTR的野生型双荧光素酶报告基因质粒和突变型双荧光素酶报告基因质粒,并将其与bta-miR-22-3p mimics、mimics NC共转染至人胚肾细胞(HEK 293T细胞)中,检测其双荧光素酶活性。miRNA Base数据库中bta-miR-22-3p的序列为AAGCUGCCAGUUGAAGAACU G;Target scan预测出bta-miR-22-3p共有包括KSR2基因在内的568个潜在靶基因,其中包括612个保守位点和190个低保守位点,并且在KSR2基因3’UTR的829-836 bp处存在潜在的bta-miR-22-3p的结合位点;构建的野生型质粒和突变型质粒经双酶切后释放出大小315 bp的条带,测序结果与预期一致,说明质粒构建成功;bta-miR-22-3p mimics能够显著降低(P<0.01)KSR2野生型质粒双荧光素酶的活性。最终说明,牦牛KSR2基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并且该基因与bta-miR-22-3p存在靶向关系。

LncRNA NEAT1调控miR-22-3p对脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞生物学活性影响

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)核富集转录本1(nuclear-enriched abundant transcript 1,Neat1)调控微小RNA miR-22-3p对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)生物学活性的影响。方法取对数生长期的HGFs细胞分为对照组、LPS组、si-NC组、si-Neat1组、si-Neat1+inhibitor NC组、si-Neat1+miR-22-3p inhibitor组。RT-qPCR检测Neat1、miR-22-3p表达水平;双荧光素酶验证Neat1、miR-22-3p的靶向关系;流式细胞仪、CCK-8、ELISA法分别检测细胞凋亡、细胞活力及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平;蛋白质印迹检测Caspase-3、磷酸化核转录因子-κB(phosphorylated nuclear factor-κB,p-NF-κB)P65/NF-κB P65水平。结果与对照组比较,LPS组细胞活力、miR-22-3p表达显著降低,TNF-α、IL-1β、细胞凋亡率、p-NF-κB P65/NF-κB P65、Neat1、Caspase-3表达显著增加(P<0.05);与LPS组、si-NC组比较,si-Neat1组细胞活力、miR-22-3p表达显著增加,TNF-α、IL-1β、细胞凋亡率、p-NF-κB P65/NF-κB P65、Neat1、Caspase-3表达显著降低(P<0.05);下调miR-22-3p表达逆转了沉默Neat1对LPS诱导HGFs生物学活性的影响(P<0.05)。结论沉默Neat1可以抑制LPS诱导HGFs的细胞凋亡、炎症反应,可能与上调miR-22-3p表达有关。

miR-192-5p和miR-22-3p在痛风性关节炎患者中的表达水平及调节机制

目的:分析痛风性关节炎患者血清miR-192-5p和miR-22-3p的表达水平及调节机制。方法:将秦皇岛市第一医院2020年1月2021年12月收治65例痛风性关节炎患者和65例健康体检人员分别分为观察组和对照组,采用实时荧光定量PCR法检测患者血清miR-192-5p和miR-22-3p的表达水平及相对表达量,采用红细胞沉降压积仪检测红细胞沉降率(ESR),用全自动生化分析仪检测血尿酸(BUA)。结果:与对照组比较,观察组患者血清miR-192-5p和miR-22-3p相对表达量升高(均P<0.05),ESR和BUA升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10表达水平升高(均P<0.05),Th1细胞表达水平和Th1/Th2比值升高(均P<0.05),Th2细胞表达水平降低(P<0.05)。ROC曲线分析发现,血清miR-192-5p和miR-22-3p在痛风性关节炎中具有良好的诊断效能。结论:痛风性关节炎患者血清miR-192-5p和miR-22-3p异常升高,其可能机制与炎症反应和免疫反应相关。

AKT3逆转miR-22-3p/29a-3p对LX-2细胞活化的协同抑制作用

目的探讨丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT3)能否逆转miR-22-3p/29a-3p对人肝星状细胞LX-2活化的协同抑制作用。方法利用TargetScan、Starbase、miRDB和DIANA预测miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因,对筛选出的靶基因进行KEGG、GO和蛋白-蛋白互作(PPI)分析;RNAhybrid分析候选靶基因与两个miRNAs结合的自由能,并通过双萤光素酶报告实验确定它们的靶向关系;采用CCK-8、Transwell和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测LX-2细胞增殖、迁移以及纤维化标志物的表达。结果miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因有24个,且它们富集在与肝纤维化相关的信号通路和生物学过程;候选靶基因AKT3与miR-22-3p和miR-29a-3p的结合自由能分析结合双萤光素酶实验结果提示AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因;miR-22-3p和miR-29a-3p mimics能够单独或协同抑制LX-2细胞的增殖、迁移以及纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原α1链(COL1A1)mRNA的表达(P<0.05),AKT3过表达后能够逆转miR-22-3p和miR-29a-3p mimics对LX-2细胞的上述协同抑制作用(P<0.05)。结论AKT3过表达可逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞活化的协同抑制作用。

miR-22-3p调控NTRK2基因对肺鳞癌增殖和凋亡的机制

目的探讨miR-22-3p靶向酪氨酸激酶受体(NTRK)2对肺鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肺鳞癌组织和癌旁组织中miR-22-3p和NTRK2 mRNA水平,Western印迹检测NTRK2蛋白水平。转染miR-22-3p mimics或NTRK2小干扰RNA至肺鳞癌H226细胞,qRT-PCR检测miR-22-3p及Western印迹检测NTRK2蛋白水平验证转染效果,CCK-8法检测过表达miR-22-3p或沉默NTRK2对H226细胞增殖的影响,流式细胞仪检测各组细胞凋亡。双荧光素酶实验验证miR-22-3p与NTRK2的靶向关系。结果肺鳞癌组织中miR-22-3p水平比癌旁组织明显降低,NTRK2 mRNA和蛋白水平比癌旁组织明显升高(均P<0.05)。过表达miR-22-3p或沉默NTRK2后,H226细胞增殖明显减低,凋亡明显增加(均P<0.05)。过表达NTRK2逆转了miR-22-3p对H226细胞的增殖和凋亡。结论miR-22-3p通过靶向NTRK2抑制肺鳞癌H226细胞增殖,并促进其凋亡。

miR-22-3p靶向抑制SIRT1信号通路加重慢性阻塞性肺疾病

目的探讨miR-22-3p是否通过沉默信息调节因子1(SIRT1)信号通路影响慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生发展。方法将大鼠随机分为5组:对照组、模型组、antagomir-NC组、antagomir-miR-22-3p组和antagomir-miR-22-3p+EX527组,每组12只。对照组大鼠正常饲养,其他组大鼠建立香烟烟雾(CS)和脂多糖(LPS)诱导的COPD大鼠模型。CS暴露当天开始,模型组、antagomir-NC组、antagomir-miR-22-3p组和antagomir-miR-22-3p+EX527组大鼠分别尾静脉注射生理盐水、antagomir-NC、antagomir-miR-22-3p和SIRT1抑制剂EX527,每2周注射1次,CS暴露90 d内共注射6次。CS暴露90 d后,使用肺功能分析系统测定肺功能指标:最大自主分钟通气量(MVV)、0.3 s用力呼气量(FEV0.3)、用力肺活量(FVC)和最大呼气峰流速(PEF)。按照ELISA试剂盒测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)水平。按照试剂盒说明对肺组织进行苏木素伊红(HE)染色。按照试剂盒说明检测肺组织氧化应激指标[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]。通过RT-PCR检测肺组织中miR-22-3p和SIRT1的mRNA水平。通过Western blot检测肺组织中SIRT1、核因子-κB(NF-κB)p65、p-NF-κB p65和叉头盒O3a(FoxO3a)蛋白表达。结果与模型组和antagomir-NC组比较,antagomir-miR-22-3p组大鼠中MVV、FEV0.3/FVC和PEF升高,BALF中IL-1β、TNF-α和MIP-2水平降低,肺组织病变减轻,肺组织中SOD和CAT水平升高,MDA水平降低,miR-22-3p水平降低,SIRT1 mRNA水平升高,SIRT1和FoxO3a蛋白水平升高,p-NF-κB p65蛋白水平降低(均P<0.05)。与antagomir-miR-22-3p组比较,antagomir-miR-22-3p+EX527组大鼠中MVV、FEV0.3/FVC和PEF降低,BALF中IL-1β、TNF-α和MIP-2水平升高,肺组织病变加重,肺组织中SOD和CAT水平降低,MDA水平升高,SIRT1 mRNA水平降低,SIRT1和FoxO3a蛋白水平降低,p-NF-κB p65蛋白水平升高(均P<0.05)。结论沉默miR-22-3p通过上调SIRT1的表达有效提高了COPD大鼠的肺功能并减轻了肺损伤。

miR-22-3p靶向调控PLAGL2保护OGD/R诱导的心肌细胞损伤机制研究

目的探讨miR-22-3p在氧-糖剥夺/复氧(OGD/R)心肌细胞铁死亡中的作用及机制。方法大鼠心肌细胞系H9c2采用OGD/R处理以及转染miR-22-3p模拟物(miR-22-3p mimic)。细胞根据是否缺氧及有无转染分为常氧组、OGD/R组、OGD/R+miRNA模拟物阴性对照(miRNA-NC组)和OGD/R+miR-22-3p组。采用细胞计数(CCK-8)法检测细胞活力,酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测H9c2细胞中铁死亡指标水平,Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)及多形性腺瘤基因样蛋白2(PLAGL2)蛋白表达,双荧光素酶报告实验验证miR-22-3p和PLAGL2靶向关系。结果OGD/R处理H9c2细胞后,第4天的吸光度值低于常氧组,活性氧(ROS)及丙二醛(MDA)水平、Fe^(2+)的积累明显高于常氧组,miR-22-3p水平明显低于常氧组(t分别=3.78、4.24、2.54、4.47、3.53,P均<0.05),H9c2细胞转染miR-22-3p mimic及OGD/R处理后,第3、4天的吸光度值高于miR-NC+OGD/R组(t分别=2.98、1.97、2.57、2.46,P均<0.05),细胞MDA、ROS、Fe^(2+)明显低于OGD/R+miR-NC组(t分别=2.62、5.35、4.11,P均<0.05),Gpx4表达水平高于OGD/R+miR-NC组。Fer-1和OGD/R处理H9c2细胞后,第3、4天的细胞吸光度值明显高于OGD/R组(t分别=3.12、3.36,P均<0.05),细胞MDA、ROS和Fe^(2+)水平显著低于OGD/R组(t分别=3.03、5.33、2.48,P均<0.05)。H9c2细胞转染miR-22-3p组的PLAGL2蛋白表达明显低于miR-NC组,且PLAGL2-WT+miR-22-3p组的荧光素酶活性明显低于PLAGL2-MUT+miR-22-3p组(t=2.69,P<0.05)。H9c2细胞共转染miR-22-3p mimic和PLAGL2过表达质粒后,Gpx4表达低于OGD/R+miR-22-3p组,吸光度值明显低于OGD/R+miR-22-3p组(t分别=3.91、3.12,P均<0.05),MDA、Fe^(2+)、ROS水平高于OGD/R+miR-22-3p组(t分别=3.78、3.87、3.05,P均<0.05)。结论miR-22-3p靶向调控PLAGL2表达抑制铁死亡,进而降低OGD/R诱导的心肌细胞损伤。

miR-22-3p靶向NLRP3表达对脑缺血再灌注损伤大鼠细胞焦亡的影响

目的:探究miR-22-3p对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠细胞焦亡的作用及其对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)表达的靶向调控机制。方法:选取2019年12月至2020年3月甘肃医学院附属医院收治的45例急性缺血性脑卒中患者(CIRI)作为研究对象,并选同期体检的健康志愿者40例作为对照组,qRT-PCR检测血清miR-22-3p和NLRP3等相关基因表达,并进行相关性分析;双荧光素酶基因报告分析miR-22-3p与NLRP3的关系;线栓法构建CIRI大鼠模型。Sham组大鼠在造模过程中仅暴露不结扎,造模手术前4 h,CIRI+mimic组大鼠侧脑室注射10µl miR-22-3p-mimic,CIRI+mimic+pc大鼠侧脑室注射10µl miR-22-3p-mimic和pcDNA3.1-NLRP3,Sham组和CIRI组大鼠侧脑室注射等剂量miR-22-3p-mimic-NC。TTC染色检测各组大鼠脑梗死面积,尼氏染色检测各组大鼠脑组织神经细胞活性;ELISA检测大鼠血清IL-1β和IL-18含量;免疫组化检测各组大鼠脑组织半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)表达;Western blot检测各组大鼠脑组织NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)表达。结果:与对照组相比,CIRI患者血清miR-22-3p、Akt、JAK1、PI3K、STAT3等基因表达明显下降,NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、ASC等基因表达明显升高(P<0.05)。CIRI患者血清miR-22-3p与NLRP3(r=−0.80,P=0.000)、IL-1β(r=−0.20,P=0.002)、IL-18(r=−0.25,P=0.004)、Caspase-1(r=−0.35,P=0.005)、ASC(r=−0.30,P=0.001)等基因表达呈负相关。miR-22-3p靶向调控NLRP3表达。过表达miR-22-3p明显降低CIRI大鼠脑梗死面积,增强神经细胞活性,下调IL-1β和IL-18含量及Cas-pase-1、NLRP3、ASC表达。而pcDNA3.1-NLRP3能明显逆转这些抑制作用。结论:CIRI中,miR-22-3p能够靶向调控NLPR3表达抑制神经元细胞焦亡,发挥神经保护作用。

血清骨生成诱导因子及miR-22-3p表达水平对2型糖尿病肾病早期诊断价值研究

目的分析血清骨生成诱导因子(osteoinductive factor,OIF)和微小核糖核酸(microRNA,miR)-22-3p在2型糖尿病肾病(type 2 diabetes nephropathy,T2DN)早期诊断中的价值。方法选取2018年3月~2020年3月重庆医科大学附属遂宁市中心医院2型糖尿病患者190例为研究对象,根据24h尿微量清蛋白排泄率(24 hour urinary microalbumin excretion rate,24h UAER)分为糖尿病无肾病组(n=58)、早期糖尿病肾病组(n=62)及临床糖尿病肾病组(n=70)。并以同期体检的健康体检者50例为健康对照组。比较各组血清OIF和miR-22-3p水平,Pearson法分析血清OIF,miR-22-3p表达与肾功能指标的相关性。采用受试者工作曲线分析血清OIF和miR-22-3p及联合检测对早期2型糖尿病肾病的诊断效能。结果糖尿病无肾病组、早期糖尿病肾病组及临床糖尿病肾病组血清OIF(7.81±1.31pg/ml,9.75±1.45 pg/ml,13.44±1.61pg/ml)和miR-22-3p(1.03±0.18,5.43±0.81,7.42±0.95)表达水平均高于健康对照组(6.42±1.22 pg/ml,0.82±0.12),差异有统计学意义(t=5.675~48.790,均P<0.05)。早期糖尿病肾病组血清OIF,miR-22-3p表达高于糖尿病无肾病组(t=7.673,40.436,均P<0.05),临床糖尿病肾病组血清OIF,miR-22-3p表达高于早期糖尿病肾病组(t=13.766,12.863,均P<0.05),差异具有统计学意义。糖尿病无肾病组、早期糖尿病肾病组和临床糖尿病肾病组血清尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER表达水平依次升高(t=1.847~47.555,均P<0.05),eGFR表达水平依次降低(t=10.018,5.416,P<0.05),差异均有统计学意义。血清OIF和miR-22-3p表达水平与尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER呈正相关(r=0.510~0.604,均P<0.01),与eGFR呈负相关(r=-0.476,-0.408,均P<0.01);血清OIF,miR-22-3p及联合检测对早期2型糖尿病肾病诊断的曲线下面积(area under the curve,AUC)及95%置信区间(95%confidence intervals,95%CI)分别为0.815(95%CI:0.761~0.859),0.726(95%CI:0.706~0.812)及0.893(95%CI:0.849~0.950)。联合检测血清OIF,miR-22-3p对早期糖尿病肾病的诊断效能高于单一指标(Z=2.305,2.616,P=0.018,0.010)。结论2型糖尿病肾病患者血清OIF和miR-22-3p表达升高,两者与尿酸、糖化血红蛋白、24h UAER及eGFR有关,联合检测有助于2型糖尿病肾病的早期诊断。

miR-22-3p靶向AEG-1抑制非小细胞肺癌细胞增殖

目的揭示miR-22-3p在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及作用机制。方法 q RT-PCR检测76例NSCLC组织及癌旁组织中miR-22-3p的表达,统计分析其与患者年龄、性别、肿瘤大小、病理分型、分级及淋巴结转移等临床参数的关系;生长曲线实验检测miR-22-3p对NSCLC细胞增殖的影响;在线软件Targetscan预测miR-22-3p的靶基因,荧光素酶活性分析及q RT-PCR进行验证。结果 miR-22-3p在NSCLC组织中的表达高于癌旁组织,与淋巴结转移相关,增加其在A549细胞中的表达可抑制细胞增殖;Targetscan预测到AEG-1为miR-22-3p的靶基因,荧光素酶活性分析与q RT-PCR证实miR-22-3p可与AEG-1 3′UTR结合,并可抑制A549细胞中AEG-1的表达。结论 miR-22-3p可能通过靶向AEG-1抑制NSCLC细胞增殖。

miR-141-3p和miR-22-3p在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的探讨miR-141-3p和miR-22-3p在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征及预后的关系。方法选择2014年1月-2017年1月在河北省邯郸市中心医院普外三科进行手术治疗的胰腺癌患者92例,取其病灶标本及癌旁组织标本,检测其miR-141-3p、miR-22-3p表达量的差异,进一步根据胰腺癌组织中的表达量中位数分为高表达、低表达组各46例。比较不同miR-141-3p、miR-22-3p表达的胰腺癌患者临床病理特征差异,分析不同miR-141-3p、miR-22-3p表达对患者预后的影响,采用COX多因素风险回归模型分析影响胰腺癌患者预后的危险因素。结果胰腺癌组织中miR-141-3p、miR-22-3p的表达量均低于癌旁组织(t=25.883、42.527,P均<0.01)。不同miR-141-3p表达的胰腺癌患者中TNM分期、肿瘤分化程度、远处转移的分布差异有统计学意义(χ^2=4.246、6.500、4.423,P均<0.05),不同miR-22-3p表达的胰腺癌患者中远处转移的分布差异有统计学意义(χ^2=14.331,P<0.01);miR-141-3p、miR-22-3p低表达组患者的生存率低于高表达组患者(χ^2=6.873、5.999,P均<0.05)。TNM分期较高、肿瘤分化程度较低、远处转移、miR-141-3p低表达、miR-22-3p低表达均是导致胰腺癌患者预后不良的危险因素(RR=2.771、1.781、3.185、1.609、1.717,P均<0.05)。结论胰腺癌组织中miR-141-3p、miR-22-3p均呈低表达,可能参与疾病发生发展,且在疾病预后的评估方面具有一定意义。

重症急性胰腺炎患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p与并发肺损伤的相关性

目的探讨重症急性胰腺炎(SAP)患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p与并发肺损伤(ALI)的相关性。方法选择2017年7月~2020年2月本院收治的124例SAP患者作为研究对象,按照是否合并ALI分为单纯SAP组(78例)、SAP合并ALI组(46例);另选择同期体检的50例健康志愿者作为对照组。采集患者外周静脉血,采用实时荧光反转录定量聚合酶链式反应检测miR-21-3p、miR-22-3p表达,收集SAP患者临床资料。结果单纯SAP组、SAP合并ALI组患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p显著高于对照组(P<0.05);SAP合并ALI组高于单纯SAP组(P<0.05)。不同CT分级、伴有胸水与否、急性生理学与慢性健康状况Ⅱ(APACHEⅡ)评分患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平比较差异具统计学意义(P<0.05);CT分级为E级、合并胸水、APACHEⅡ评分≥15分患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平高于CT分级为D级、无胸水、APACHEⅡ评分<15分的患者(P<0.05)。Logistic回归分析显示,CT分级、胸水、外周血miR-21-3p、miR-22-3p表达水平与SAP患者并发ALI相关(P<0.05)。外周血miR-21-3p、miR-22-3p诊断ALI曲线下面积(AUC)为0.770、0.812,当截点值为2.668、1.815时,约登指数最大;两者联合诊断AUC为0.869。结论SAP患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p与ALI并发密切相关,临床可检测其水平明确SAP程度及是否发生ALI,对指导临床治疗具有重要价值。

NLRP3基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及miR-22-3p靶向调控

目的构建核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3,NLRP3)基因3'非编码区(untranslated region,UTR)野生型及突变型双荧光素酶报告质粒载体,分析微小RNA(miR)-22-3p对NLRP3的调控作用。方法应用生物信息软件预测miR-22-3p与NLRP3基因的结合位点;将NLRP3基因的3'UTR序列及其突变体克隆到双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中,构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及基因测序方法鉴定载体是否构建成功;将培养的人胚肾293T细胞(HEK293T)分为4组:(1) miR-22-3p对照+psi CHECK2;(2) miR-22-3p对照+psi CHECK2-NLRP3-3'UTR(野生型);(3) miR-22-3p模拟物(mimic)+psi CHECK2-NLRP3-3'UTR(野生型);(4) miR-22-3p模拟物(mimic)+psi CHECK2-NLRP3-3'UTR^(mut)(突变型),分别检测细胞荧光素酶活性。结果成功构建了NLRP3基因3'UTR野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒载体; NLRP3-3'UTR野生型与miR-22-3p mimic共转染293T细胞后,荧光素酶活性降低,下降43%,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论成功构建NLRP3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒载体并初步验证miR-22-3p对NLRP3的调控作用。

miR-22-3p在鼻咽癌中的表达及靶基因功能分析

目的目前关于鼻咽癌中miR-22-3p的表达情况和作用机制尚不明确。文中旨在研究miR-22-3p在鼻咽癌中的表达情况,分析其表达对鼻咽癌发生发展的影响。方法从GEO数据库中下载鼻咽癌组织miRNA表达数据GSE36682,分析miR-22-3p在鼻咽癌组织中的表达变化,应用qRT-PCR在鼻咽癌细胞中进一步验证。根据慢病毒转染分为:过表达组(转染miR-22-3p过表达慢病毒)、阴性对照组(空载病毒)、空白组(不转染)。应用生物信息学软件及数据集GSE53819中预测并筛选表达有差异的靶基因,并进行GO功能及KEGG通路富集分析,同时构建靶基因的蛋白互作网络并找出其关键基因,探究miR-22-3p表达失调在鼻咽癌中发生发展过程中的作用。结果鼻咽癌中miR-22-3p呈明显低表达(P<0.01)。ROC曲线表明在鼻咽癌中miR-22-3p的表达具有一定诊断效能(AUC:0.984,95%CI:0.970~0.998)。过表达组WNT5A相对表达量(0.423±0.079)明显低于空白组(1.000±0.000)、阴性对照组(0.915±0.237),差异有统计学意义(P<0.05);CXCL5亦明显降低(P<0.05)。在生物信息学软件及数据集中预测并筛选后得到201个差异表达的miR-22-3p的靶基因,GO功能分析表明miR-22-3p靶基因产物主要涉及对无机及有机物质的反应、Wnt受体信号通路等生物学过程,还包括跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白域特异性结合等分子功能,KEGG通路富集分析表明这些靶基因主要参与趋化因子信号通路、癌症通路。此外,WNT5A、GNG7、CXCR5、CCR7、CXCL5、TFRC、STAT1、CX3CR1、KIAA0319为筛选出的miR-22-3p的关键靶基因,其中WNT5A、CXCL5、TFRC、STAT1呈现表达上调,CXCR5、GNG7、CCR7、CX3CR1、KIAA0319呈现表达下降(P<0.01)。预后分析发现GNG7、CXCR5、CCR7、CX3CR1低表达及TFRC的高表达与头颈部鳞癌的不良预后具有明显的相关性(P<0.01)。结论miR-22-3p在鼻咽癌中表达下调,可能通过调控其靶基因WNT5A、CXCL 5等在鼻咽癌中发挥重要作用。

miR-22-3p在腹主动脉瘤中对金属基质蛋白酶-9作用的实验研究

目的:探讨miR-22-3p在小鼠腹主动脉瘤模型中对金属基质蛋白酶-9(MMP-9)的作用。方法:20只apoE基因敲除(apoE-/-)雄性小鼠均等为血管紧张素II(Ang-II)组与对照组,对照组无处理,Ang-II组给予Ang-II(1 500ng·min^(-1)·kg^(-1),6w)微量泵持续灌注,超声观测6周后腹主动脉成瘤率。6周后取成瘤小鼠血管组织RNA,实时PCR测量miR-22-3p的表达;提取野生小鼠血管组织中平滑肌细胞、成纤维细胞与巨噬细胞进行原代培养,同时进行上述三种细胞系及内皮细胞系的培养,实时PCR检测各种细胞miR-22-3p的表达以发现其细胞来源。取10只apoE-/-雄性小鼠随机分为实验组与对照组,均给予Ang-II微量泵灌注,agomiR-22组内眦静脉注射agomiR-22,对照组内眦静脉注射agomiR空载体(agomiR-NC),每5天1次。6周后超声观测腹主动脉成瘤率,免疫组化染色观察血管组织中MMP-9的表达。结果:与对照组相比,6周后Ang-II组主动脉组织中miR-22-3p表达显著下降[(0.00079±0.00029)vs.(0.00042±0.00023),P<0.05]。在各种原代与细胞系培养中,miR-22-3p仅于平滑肌细胞上表达,在灌泵6周apoE-/-小鼠中补miR-22-3p后,腹主动脉瘤成瘤率明显下降(75%vs.0,P<0.05);MMP-9含量显著下降。结论:在腹主动脉瘤形成过程中,miR-22-3p仅在平滑肌细胞表达且降低,MMP-9升高,但补充后miR-22后降低,提示miR-22-3p可能通过下调MMP-9的表达抑制腹主动脉瘤的发生。

miR-22-3p调控TCTN1基因对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的机制研究

目的:探讨miR-22-3p对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:qRT-PCR检测正常皮肤组织和皮肤鳞状细胞癌组织中miR-22-3p和TCTN1 mRNA水平,Western blot检测TCTN1蛋白水平。转染miR-22-3p mimics或果,MTT法检测过表达miR-22-3p或沉默TCTN1表达对A431细胞增殖的影响,流式细胞术检测过表达miR-22-3p或沉默TCTN1表达对A431细胞凋亡的影响,Western blot检测过表达miR-22-3p或沉默TCTN1表达对A431细胞CyclinD1、Ki-67、Cleaved caspase-3蛋白表达的影响。生物信息学软件预测显示TCTN1的3′UTR中含有与miR-22-3p互补的核苷酸序列,双荧光素酶报告基因实验验证miR-22-3p与TCTN1的靶向关系。结果:与正常皮肤组织相比,皮肤鳞状细胞癌组织中miR-22-3p水平明显降低(P<0.05),TCTN1 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05)。过表达miR-22-3p或沉默TCTN1表达后,A431细胞活性、靶向负调控TCTN1表达。过表达TCTN1逆转了过表达miR-22-3p对A431细胞增殖、凋亡及相关蛋白CyclinD1、Ki-67和Cleaved caspase-3表达的影响。结论:过表达miR-22-3p通过靶向负调控TCTN1表达抑制皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖,并促进其凋亡。

lncRNA NKILA靶向miR-22-3p调控高糖诱导的人足细胞增殖和凋亡

目的研究核因子(NF)-κB相关长链非编码RNA(lncRNA NKILA)对高糖诱导的人足细胞(HPC)增殖和凋亡的影响及潜在机制。方法将HPC细胞分为正常对照组(NC)、高糖刺激组(HG)、高糖刺激+转染组,NC组用11.1 mmol/L D-葡萄糖处理,HG组用25 mmol/L D-葡萄糖处理,高糖刺激+转染组将细胞转染后进行25 mmol/L D-葡萄糖处理。qRT-PCR检测HPC细胞中lncRNA NKILA和miR-22-3p的含量,Western印迹检测细胞周期蛋白(cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)-3、磷酸化(p)-磷脂酰肌酶-3激酶(PI3K)和p-蛋白激酶B(AKT)蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证lncRNA NKILA与miR-22-3p的关系。结果与NC组相比,HG组的HPC细胞lncRNA NKILA含量及细胞凋亡率显著升高(均P<0.05),miR-22-3p含量及存活率显著降低(均P<0.05);低表达lncRNA NKILA抑制cleaved-caspase-3表达,促进cyclinD1、p-PI3K和p-AKT表达,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率;高表达miR-22-3p可提高高糖处理后HPC细胞存活率和cyclinD1含量,降低细胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白含量;lncRNA NKILA靶向结合miR-22-3p,并负调控miR-22-3p的表达;低表达miR-22-3p可部分逆转抑制lncRNA NKILA对HPC增殖和凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响。结论lncRNA NKILA可能靶向miR-22-3p通过PI3K/AKT信号通路调控高糖诱导的HPC细胞凋亡和存活率。

五味子乙素调控miR-22-3p/RUNX3分子轴对重症急性胰腺炎腺泡细胞损伤影响的研究

目的:探讨五味子乙素(Sch B)调控miR-22-3p/runt相关转录因子3 (RUNX3)分子轴对重症急性胰腺炎(SAP)腺泡细胞损伤的影响。方法:将大鼠胰腺腺泡细胞AR42J分为Con组、SAP组、SAP+Sch-L组、SAP+Sch-M组、SAP+Sch-H组、SAP+anti-miR-NC组、SAP+anti-miR-22-3p组、SAP+Sch+miR-NC组、SAP+Sch+miR-22-3p组。除Con组外,其余各组采用10 nmol/L雨蛙素联合10 mg/L脂多糖刺激AR42J细胞24 h构建SAP细胞模型。SAP+Sch-L组、SAP+Sch-M组、SAP+Sch-H组采用浓度为10、20、40μmol/L的Sch B处理细胞;SAP+anti-miR-NC组、SAP+anti-miR-22-3p组为分别转染antimiR-NC、anti-miR-22-3p;SAP+Sch+miR-NC组、SAP+Sch+miR-22-3p组为分别转染miR-NC、miR-22-3p mimics并用40μmol/L的Sch B干预。酶联免疫吸附法测定细胞培养液上清中白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测miR-22-3p和RUNX3 mRNA表达水平;BCA法检测RUNX3、B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (cleaved-caspase3)表达水平;双荧光素酶报告基因实验检测miR-22-3p与RUNX3的靶向结合关系。结果:与Con组比较,SAP组AR42J细胞IL-6、TNF-α、miR-22-3p、Bax、cleaved-caspase3的表达及细胞凋亡率升高(P<0.05),RUNX3、Bcl-2的表达降低(P<0.05)。与SAP组比较,SAP+Sch-L组、SAP+Sch-M组、SAP+Sch-H组IL-L、TNF-α、miR-22-3P、Bcl-2表达降低(P<0.05),Bax、cleaved-caspase3、RUNX3表达及细胞凋亡率升高(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。与SAP+anti-miR-NC组比较,SAP+anti-miR-22-3p组细胞IL-6、TNF-α、Bcl-2的表达降低(P<0.05),细胞凋亡率及Bax、cleaved-caspase3、RUNX3的表达升高(P<0.05)。与SAP+Sch+miR-NC组比较,SAP+Sch+miR-22-3p组细胞IL-6、TNF-α、Bcl-2的表达升高(P<0.05),细胞凋亡率及Bax、cleavedcaspase3、RUNX3的表达降低(P<0.05)。结论:Sch B可通过下调miR-22-3p/RUNX3分子轴减轻SAP腺泡细胞损伤。

重症急性胰腺炎患者外周血miR-22-3p和miR-324-5p水平及其对重症急性胰腺炎相关性急性肺损伤的诊断价值分析

目的检测miR-22-3p、miR-324-5p在重症急性胰腺炎(SAP)患者外周血中表达情况,探讨二者与SAP患者临床病理参数的关系及在SAP相关性急性肺损伤(ALI)诊断中的应用价值。方法回顾性收集2015年2月至2017年2月确诊并治疗的86例急性胰腺炎患者为研究对象,根据是否合并ALI分为合并ALI组(n=49)和未合并ALI组(n=37)。选取同期健康体检者45例作为健康对照组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各受试者外周血miR-22-3p、miR-324-5p水平,并计算受试者工作曲线(ROC曲线)下面积(AUC)和对SAP诊断校能,观察上述指标与临床病理参数的相关性。结果健康对照者、未合并ALI、合并ALI的SAP患者外周血miR-22-3p水平逐渐升高、miR-324-5p水平逐渐降低,两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。检测外周血miR-22-3p、miR-324-5p水平诊断SAP疾病的AUC分别为:0.729、0.683,灵敏度分别为:57.41%、50.89%,特异度分别为:83.70%、78.61%。miR-22-3p、miR-324-5p表达与SAP患者CT分级、胸水情况、APACHEⅡ评分和是否并发ALI疾病有关(P<0.05)。miR-22-3p、miR-324-5p水平诊断SAP合并ALI疾病的AUC分别为:0.791、0.748,灵敏度分别为:63.82%、58.90%,特异度分别为:83.91%、81.71%。COX比例风险模型分析结果显示,miR-22-3p、miR-324-5p水平、CT分级是影响SAP患者ALI发生风险的独立危险因素。结论 miR-22-3p在SAP患者外周血中高表达,miR-324-5p低表达,且在合并ALI患者和未合并ALI患者中存在明显差异,检测外周血miR-22-3p、miR-324-5p水平对SAP合并ALI疾病的诊断具有一定应用价值。