CircR-ZC3HC1 mediates MiR-384-5p/SIRT1 axis to promote neuronal autophagy and relieves ischemic stroke

Objective:Circular RNAs(circRNAs)have been shown to involve in pathological processes of ischemic stroke(IS),including autophagy.This study was designed to explore the effect of circR-ZC3HC1 on neuronal autophagy in IS and the related mechanisms.Methods:Expression of circR-ZC3HC1 in blood samples of IS patients and healthy controls was detected.Hippocampal neurons were treated with oxygen and glucose deprivation(OGD)to establish IS in vitro model.The expression of LC3 and p62 and the number of autophagosomes were examined to evaluate the autophagy level of OGD induced neurons using western blotting and transmission electron microscope.Cell apoptosis rate and the expression of cleaved caspase-3,Bax,and Bcl-2 were assessed byflow cytometry and western blotting.The binding relationships among circR-ZC3HC1,miR-384-5p,and SIRT1 were predicted and verified.Results:Low expression of circR-ZC3HC1 was found in blood samples of IS patients and OGD-treated neurons.Overexpressed circR-ZC3HC1 or inhibited miR-384-5p expression promoted autophagy and inhibited apoptosis of OGD-treated neurons,which could be reversed by further 3-MA treatment.Mechanistically,circR-ZC3HC1 targeted miR-384-5p to mediate SIRT1 expression.miR-384-5p overexpression or SIRT1 knockdown in the presence of circR-ZC3HC1 overexpression in OGD-treated neurons lead to reduced autophagy and enhanced apoptosis.Conclusion:Collectively,circR-ZC3HC1 promoted neuronal autophagy to attenuate IS via miR-384-5p/SIRT1 axis.

血清miR-384、PTBP3水平与妊娠期高血压疾病患者不良妊娠结局的关系

目的检测妊娠期高血压疾病(HDCP)患者血清微RNA(miR)-384、多聚嘧啶区结合蛋白3(PTBP3)表达水平,研究miR-384、PTBP3与患者不良妊娠结局的关系。方法回顾性选取2020年7月至2021年7月沧州市人民医院收治的100例HDCP患者作为观察组,另选取同期本院的健康孕妇50名作为对照组。根据观察组患者妊娠结局情况分为妊娠结局不良组(n=47),妊娠结局良好组(n=53)。比较各组临床资料,检测对比各组血清miR-384、PTBP3水平。采用Pearson相关性分析法分析受试者血清miR-384、PTBP3表达水平相关性;采用受试者操作特征(ROC)曲线评估二者对HDCP患者不良妊娠结局的预测价值;采用多因素Logistic回归分析对患者不良妊娠结局的影响因素进行分析。结果妊娠结局不良组的收缩压和舒张压分别为(162.34±14.95)、(108.11±10.01)mmHg,均高于妊娠结局良好组[(138.78±13.11)、(99.35±6.03)mmHg]和对照组[(115.25±10.22)、(73.56±4.66)mmHg],差异均有统计学意义(P<0.05)。妊娠结局不良组miR-384水平为1.56±0.14,高于妊娠结局良好组(1.23±0.11)和对照组(1.01±0.15),差异均有统计学意义(P<0.05)。妊娠结局不良组PTBP3水平为(0.67±0.23)ng/mL,低于妊娠结局良好组[(1.21±0.33)ng/mL]和对照组[(1.53±0.45)ng/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,观察组患者血清miR-384、PTBP3表达呈负相关(r=-0.472,P=0.001)。血清miR-384、PTBP3联合预测患者发生不良妊娠结局的曲线下面积(AUC)大于血清miR-384、PTBP3单独预测的AUC(P<0.05)。患者血清miR-384高表达是患者发生不良妊娠结局的危险因素,PTBP3高表达是患者发生不良妊娠结局的保护因素(P<0.05)。结论HDCP患者血清miR-384表达升高,PTBP3表达降低,二者均与患者发生不良妊娠结局有关。

miR-384靶向HMGA2对肝癌细胞生物学行为的影响及其机制

目的 探讨miR-384靶向高迁移率蛋白A2(HMGA2)对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法 对数生长期HUH7细胞分为对照组、miR-384 NC组和miR-384 mimic组,qRT-PCR法检测miR-384表达情况,MTT法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶基因报告法检测靶向关系,蛋白印迹法检测HMGA2、上皮钙粘蛋白(E-cad)、神经钙粘蛋白(N-cad)和波形蛋白(Vimentin)相对表达量。结果 人肝癌细胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表达水平低于人肝脏正常上皮细胞THLE3中miR-384表达水平。对照组和miR-384 NC组miR-384表达水平、细胞存活率、迁移和侵袭细胞数以及HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与miR-384 NC组比较,miR-384 mimic组miR-384表达水平升高,细胞存活率降低,迁移和侵袭细胞数减少,HMGA2、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量降低,E-cad蛋白相对表达量升高(P<0.05)。结论 miR-384过表达可抑制肝癌HUH7细胞增殖,降低癌细胞迁移和侵袭能力,其可能是通过降低HMGA2表达,调节上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达发挥作用。

木犀草素上调miR-384对胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的研究木犀草素(luteolin)对胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的作用及机制。方法以质量浓度2.5、25和50μmol·L^(-1)Luteolin1处理U251和U87细胞。分别以克隆形成实验、流式细胞术、Transwell实验检测细胞克隆形成、凋亡和侵袭。采用Lipofectamine 2000将antagomir-NC、miR-384 antagomir转染胶质瘤细胞U251。以RT-qPCR检测胶质瘤细胞中miR-384的表达水平。转染miR-384 antagomir后用质量浓度50μmol·L^(-1)的luteolin处理,以蛋白免疫印迹法(western blot)检测各组细胞中Ki67、p21、VEGF、Bax、Bcl-2和N-cadherin蛋白相对表达水平。结果结果表明CCK-8浓度>25μmol·L^(-1)时luteolin可显著降低U251和U87细胞活力;与对照组相比,以质量浓度25和50μmol·L^(-1)luteolin处理可明显降低细胞克隆形成率和侵袭率、提升细胞凋亡率。与miR-384 antagomir对胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响转染组比较,miR-384 antagomir+luteolin(50μmol·L^(-1))处理可显著下调Ki67、VEGF、Bcl-2和N-cadherin蛋白表达水平,上调p21和Bax蛋白表达水平。结论木犀草素可通过上调miR-384水平抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭能力并诱导其凋亡。

新生儿缺氧缺血性脑病血清miR-384与炎症反应、神经行为的相关分析

目的 探讨新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)血清微小分子核糖核酸-384(miR-384)表达水平与炎症反应、辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)失衡及神经行为的相关性。方法 选择2015年10月至2020年10月唐山市妇幼保健院收治的106例HIE患儿为HIE组,另选取同期同院产科分娩的90例健康新生儿为对照组。参考HIE分度标准将患儿分成轻、中、重度组,比较各组血清miR-384、白介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Treg、Th17、Th17/Treg与新生儿神经行为量表(NBNA)评分。经Pearson线性相关分析HIE患儿血清miR-384与炎症因子、Treg、Th17、Th17/Treg、NBNA评分的相关性。结果 HIE组血清miR-384、Treg水平及NBNA评分低于对照组,Th17、Th17/Treg、IL-6、CRP、TNF-α水平高于对照组,差异均有统计学意义(t值介于-21.533~30.802之间,P<0.05);HIE轻、中、重度组血清miR-384、Treg水平及NBNA评分均依次降低,Th17、Th17/Treg、IL-6、CRP、TNF-α水平均依次升高,差异有统计学意义(F值介于82.368~513.891之间,P<0.05);HIE患儿血清miR-384与IL-6、CRP、TNF-α、Th17、Th17/Treg呈负相关(r值介于-0.867~-0.406之间,P<0.05),与Treg、NBNA评分呈正相关(r值分别为0.671、0.776,P<0.05)。结论 HIE患儿病情越重,miR-384水平下降越明显;miR-384表达与患儿的炎症反应、Th17/Treg免疫平衡及神经行为能力密切相关。

LINC00342调控miR-384对肺鳞癌细胞增殖侵袭迁移的影响研究

目的:探讨LINC00342通过miR-384对肺鳞癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法:将肺鳞癌SK-MES-1细胞分为:ctrl组(正常培养的SK-MES-1细胞)、si-NC组(转染si-NC)、si-LINC00342组(转染si-LINC00342)、si-LINC00342+inhibitor-NC组(si-LINC00342和inhibitor-NC共转染)、si-LINC00342+miR-384 inhibitor组(si-LINC00342和miR-384 inhibitor共转染);RT-qPCR检测细胞中LINC00342、miR-384表达;CCK-8法及Transwell小室法分别检测细胞增殖和侵袭;划痕实验及流式细胞仪分别检测细胞迁移和凋亡;Western blot检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达;双荧光素酶报告基因实验验证LINC00342和miR-384的关系。结果:与ctrl组、si-NC组比较,si-LINC00342组SK-MES-1细胞的OD450值、细胞侵袭数目、划痕愈合率、PCNA、MMP-2和MMP-9表达明显降低,细胞凋亡率、caspase-3表达明显上升(P<0.05);抑制miR-384表达减弱了敲低LINC00342对SK-MES-1细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用,降低了细胞凋亡能力;LINC00342靶向调控miR-384表达。结论:敲低LINC00342可能通过靶向miR-384,进而抑制SK-MES-1细胞增殖、侵袭和迁移。

lncRNA KCNQ1OT1调控miR-384/CACNA1C轴对心肌细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA钾电压门控通道亚家族Q成员1反向转录物1(lncRNA KCNQ1OT1)调控miR-384/L型钙离子通道α1C亚基基因(CACNA1C)轴对心肌细胞增殖、凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot分别检测正常培养的大鼠心肌H9c2、CP-R073细胞及缺氧/复氧(H/R)诱导的H9c2、CP-R073细胞中的KCNQ1OT1、miR-384、CACNA1C蛋白表达。将H9c2细胞分为Ct组、Model组、si-NC组、si-KCNQ1OT1组、mimic NC组、miR-384 mimic组、si-KCNQ1OT1+inhibitor NC组、si-KCNQ1OT1+miR-384 inhibitor组。除Ct组外,其他组H9c2细胞均需转染对应物质后构建H/R损伤模型。qRT-PCR检测细胞中KCNQ1OT1、miR-384表达;CCK-8法、EdU染色检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测细胞中肌红蛋白(Mb)、肌钙蛋白-Ⅰ(cTnⅠ)水平;Western blot检测CACNA1C、增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证KCNQ1OT1与miR-384、miR-384与CACNA1C的关系。结果H/R诱导的H9c2、CP-R073细胞中KCNQ1OT1、CACNA1C蛋白表达升高,miR-384表达降低,且H/R诱导的H9c2细胞中KCNQ1OT1、CACNA1C蛋白表达最高,miR-384表达最低,因此,后续选择H9c2细胞为研究对象。与Ct组比较,Model组细胞中KCNQ1OT1、细胞凋亡率、Mb、cTnⅠ水平、CACNA1C、Caspase-3、Bax蛋白表达升高,miR-384表达、D 450值、EdU阳性率、PCNA蛋白表达降低(P<0.05);沉默KCNQ1OT1或过表达miR-384可促进H/R诱导的H9c2细胞增殖,抑制细胞凋亡;miR-384 inhibitor减弱了沉默KCNQ1OT1对H/R诱导的H9c2细胞增殖的促进作用,以及对细胞凋亡的抑制作用;KCNQ1OT1靶向调控miR-384/CACNA1C轴。结论沉默KCNQ1OT1可能通过上调miR-384来抑制CACNA1C表达,进而促进H/R诱导的H9c2细胞增殖,抑制细胞凋亡。

血清miR-384、LIN28B在糖尿病视网膜病变中的表达及其诊断价值分析

目的探讨糖尿病视网膜病变(DR)患者血清中microRNA-384(miR-384)、LIN28B的表达水平及其诊断价值。方法选取2020年1月至2021年11月于本院确诊的100例2型糖尿病患者为研究对象,根据是否发生视网膜病变分为非DR组(40例)、DR组(60例);另选取同期本院的健康体检者40例作为对照组。采用qRT-PCR法检测血清miR-384、LIN28B相对表达水平,并分析两者与DR患者临床资料的关系。采用Pearson法分析DR患者血清中miR-384与LIN28B表达的相关性。采用Logistic回归分析DR发生的影响因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-384、LIN28B水平对DR患者的诊断价值。结果DR组患者血清中miR-384水平明显低于非DR组和对照组(P<0.05),且非DR组低于对照组(P<0.05);DR组患者血清中LIN28B水平明显高于非DR组和对照组(P<0.05),且非DR组高于对照组(P<0.05)。miR-384、LIN28B表达水平与患者糖尿病病程、血糖有关(P<0.05)。Pearson法分析显示,DR患者血清中miR-384与LIN28B表达呈负相关(r=-0.296,P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,miR-384、LIN28B是DR发生的独立影响因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,miR-384、LIN28B及二者联合检测诊断DR患者的曲线下面积(AUC)分别为0.625、0.646、0.682,特异度分别为67.50%、85.00%、97.50%。结论DR患者血清中miR-384呈低表达,LIN28B呈高表达,miR-384、LIN28B均是DR发生的影响因素,并且有望成为诊断DR的潜在血清学指标。

miR-384-5p通过阻断BMP7转录后调控促进肾纤维化

目的研究miR-384-5p是否通过调节肾小管上皮细胞BMP7转录而影响肾纤维化。方法建立小鼠单侧输尿管阻塞模型(unilateral ureteral obstructive,UUO),流式细胞仪荧光激活细胞分选(FACS)分离肾组织获取肾小管上皮细胞进行培养,通过脂质体转染表达miR-384-5p的质粒、表达反义miR-384-5p的质粒及空白质粒;静脉注射空质粒( n =10)或反义-miR-384-5p质粒( n =10),14周后处死UUO模型小鼠,肾组织切片进行Masson三色染色评估肾纤维化程度;Western blot和实时定量PCR检测miRNA靶基因(miR-384-5p、miR-30、miR-92和miR-128)表达。结果 UUO模型14 d时肾脏出现明显纤维化,肾组织BMP7 mRNA明显增加,但BMP7蛋白无明显增加。miR-384-5p没有影响肾小管上皮细胞中BMP7 mRNA表达,但是过表达miR-384-5p的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白明显减少,过表达反义miR-384-5p的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白明显增加。免疫组化和定量PCR检测结果显示,UUO小鼠14 d肾组织纤维化显著增加,而注射反义miR-384-5p组肾组织纤维化程度明显减轻。虽然反义-miR-384-5p处理后不影响BMP7 mRNA水平,但能明显增加肾脏组织BMP7蛋白表达,提示抑制miR-384-5p能减轻UUO大鼠的肾损伤。结论 miR-384-5p是调节肾损伤后纤维化机制的关键因子,靶向miR-384-5p有希望成为防治肾脏纤维化的新方法。

miR-384靶向HTRA1影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡

目的:明确miR-384对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFBs)增殖和凋亡的影响。方法:RT-qPCR和Western Blot检测miR-384和靶向高温需求因子A1(HTRA1)在KFBs和人瘢痕疙瘩皮肤组织中的表达。CCK-8细胞计数试剂盒检测KFBs增殖活力;流式细胞术检测KFBs细胞凋亡;Western Blot检测Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-384对HTRA1的靶向作用。结果:KFBs和人瘢痕疙瘩皮肤组织中miR-384呈低表达,HTRA1呈高表达。转染anti-miR-384后KFBs增殖活力升高,细胞凋亡率降低,Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低。转染si-HTRA1后KFBs增殖活力降低,细胞凋亡率增加,Ki-67、PCNA和Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高。miR-384靶向负性调控HTRA1表达。结论:miR-384可能通过靶向调控HTRA1促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,抑制细胞凋亡。

miR-384增加乳腺癌MCF-7细胞多西他赛敏感性

目的探讨miR-384对乳腺癌MCF-7细胞多西他赛(DOC)敏感性的影响。方法乳腺癌MCF-7细胞分成Control组(空白对照)、miR-NC组(转染模拟物阴性对照)、miR-384组(转染miR-384模拟物)、miR-NC+DOC组(转染模拟物阴性对照,DOC处理)、miR-384+DOC组(转染miR-384模拟物,DOC处理),MTT测定细胞增殖,克隆形成实验测定细胞克隆能力,流式细胞术测定细胞凋亡。在线靶基因预测软件预测性别决定区Y框蛋白4(SOX4)可能是miR-384的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。Western blot测定细胞中SOX4蛋白表达。pcDNA3.1-SOX4和miR-384模拟物共转染,以DOC处理,检测SOX4对上调miR-384联合DOC对乳腺癌MCF-7细胞增殖、克隆和凋亡的影响。结果与miR-NC组比较,miR-384组和miR-NC+DOC组细胞中miR-384表达水平升高,细胞增殖和克隆能力降低,细胞凋亡率升高(均P<0.05)。与miR-NC+DOC组比较,miR-384+DOC组细胞增殖和克隆能力降低,细胞凋亡率升高(均P<0.05)。miR-384靶向抑制SOX4蛋白表达。pcDNA3.1-SOX4能够逆转上调miR-384联合DOC对乳腺癌MCF-7细胞增殖、克隆和凋亡的影响。结论miR-384靶向调控SOX4,增加乳腺癌MCF-7细胞DOC敏感性。

MiR-384对HFFA诱导的Hepa1-6细胞sirt3/FOX01信号通路的影响

目的观察MiR-384对HFFA诱导的Hepa1-6细胞sirt3/FOX01信号通路的影响。方法取Hepa1-6细胞,加入OA和PA储存液,使两者终浓度分别为1 mmol/L和0.5 mmol/L,培养24 h,建立非酒精性脂肪性肝炎体外细胞模型。测定肝细胞内活性氧水平评估模型建立的情况。分别以miR-384模拟物、miR-ctrl、miR-384抑制剂、miR-384抑制剂-ctrl、沉默信息调节因子3(Sirt3)或si-ctrl转染细胞48 h。使用FCM测定各组细胞ROS水平,采用Western blot法检测各组细胞sirt3、FOX01及抗氧化蛋白锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和抗氧化蛋白过氧化氢酶(CAT)表达,采用专用试剂盒检测SOD和CAT活性。结果与正常组(0.66±0.01)比,miR-384模拟物组和sisirt3组细胞内活性氧(ROS)水平显著升高[分别为(37.3±1.13)和(10.4±0.36),P<0.01];与HFFA组(29.4±0.98)比,HFFA/miR-384抑制剂组细胞ROS水平显著降低[(12.8±0.41),P<0.01];与正常组(0.75±0.04)Hepa1-6细胞sirt3蛋白表达水平比,HFFA组显著降低[(0.23±0.01),P<0.01];与HFFA组比,HFFA/sirt3组显著增加[(0.83±0.03),P<0.01];与HFFA/sirt3组比,HFFA/sirt3/miR-384组显著降低[(0.46±0.02),P<0.01];与对照组比,miR-384模拟物组Hepa1-6细胞sirt3蛋白、Forkhead转录因子O亚家族(FOXO)成员FOX01蛋白表达显著减少[分别为(0.2±0.01)和(0.3±0.01),P<0.01],而CAT和MnSOD表达显著增加[分别为(2.3±0.05)和(2.4±0.06),P<0.01];与HFFA组比,HFFA/miR-384抑制剂组Hepa1-6细胞sirt3蛋白和FOX01蛋白表达显著增加[分别为(0.5±0.02)和(0.7±0.01),P<0.01],MnSOD和CAT表达水平显著降低[分别为(1.6±0.04)和(2.0±0.03),P<0.01];与NAFLD组SOD(327±3.45)和CAT(386±4.03)活性比,正常组SOD和CAT[分别为(425±5.49)和(512±6.04),P<0.01]和miR-384抑制剂组SOD和CAT活性[分别为(406±4.79)和(447±5.38),P<0.01]显著升高。结论 miR-384表达可导致HFFA诱导的Hepa1-6细胞氧化损伤加重,部分可能是通过抑制sirt3/FOX01途径实现的。

LINC00342靶向miR-384对肾癌细胞生物学行为的影响

目的探讨长链非编码RNA LINC00342(LncRNA LINC00342)靶向微小RNA-384(miR-384)调控肾癌细胞恶性生物学行为的分子机制。方法采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肾癌组织与癌旁组织中LINC00342的表达;将肾癌786-O细胞分为si-NC组、si-LINC00342组、si-LINC00342+anti-miR-NC组、si-LINC00342+anti-miR-384组;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭数;通过生物信息学方法预测LINC00342的靶基因,采用双荧光素酶报告实验验证靶基因的表达。结果与癌旁组织相比,肾癌组织中LINC00342的表达水平显著升高(P<0.05)。与si-NC组相比,si-LINC00342组细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高(P<0.05),迁移与侵袭细胞数显著减少(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-384可抑制野生型载体WT-LINC00342细胞的荧光素酶活性,且LINC00342可负向调控miR-384的表达(P<0.05);抑制miR-384能逆转抑制LINC00342对786-O细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。结论抑制LINC00342可通过靶向调控上调miR-384抑制肾癌细胞的恶性生物学行为。

circMTO1靶向miR-384减轻氯氮平致大鼠原代肝细胞损伤的机制研究

目的 探讨环状RNA(circRNA)circMTO1对氯氮平致大鼠原代肝细胞损伤的影响及分子机制。方法 将大鼠原代肝细胞随机分为对照组、氯氮平组、氯氮平+pcDNA3.1组、氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1组、氯氮平+miR-NC组、氯氮平+miR-384组和氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1+miR-384组。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验检测细胞存活率,实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测circMTO1和miR-384表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平,双荧光素酶报告实验验证circMTO1与miR-384的靶向关系。结果 对照组、氯氮平组、氯氮平+pcDNA3.1组、氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1组、氯氮平+miR-NC组、氯氮平+miR-384组和氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1+miR-384组大鼠原代肝细胞存活率依次为100.00%±5.37%、53.09%±8.71%、58.71%±9.26%、80.25%±12.71%、56.07%±8.02%、39.01%±5.64%、61.24%±8.35%,凋亡率依次为5.53%±0.93%、37.26%±6.20%、41.18%±5.60%、19.87%±3.03%、38.96%±5.02%、53.24%±6.01%和32.69%±4.17%。与对照组比较,氯氮平组大鼠原代肝细胞存活率和circMTO1表达水平明显降低,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显增加(P<0.05)。与氯氮平组比较,氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1组大鼠原代肝细胞存活率和circMTO1表达水平明显增加,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显降低(P<0.05)。与氯氮平组比较,氯氮平+miR-384组大鼠原代肝细胞存活率明显降低,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显增加(P<0.05)。与氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1组比较,氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1+miR-384组大鼠原代肝细胞存活率明显降低,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显增加(P<0.05)。与氯氮平+miR-384组比较,氯氮平+pcDNA3.1-circMTO1+miR-384组大鼠原代肝细胞circMTO1表达水平、细胞存活率明显增加,miR-384表达水平、凋亡率、凋亡指数、ALT和AST水平明显降低(P<0.05)。circMTO1靶向负调控miR-384的表达。结论 circMTO1可减轻氯氮平致大鼠原代肝细胞损伤,其机制可能与circMTO1靶向负调控miR-384的表达有关。

LncRNA CRNDE靶向miR-384影响结直肠癌细胞放射敏感性的研究

目的研究长链非编码RNA(Lnc RNA)结直肠肿瘤差异表达基因(CRNDE)对结直肠癌细胞放射敏感性的影响及其机制。方法以结直肠癌HT-29细胞作为体外研究对象,转染CRNDE shRNA,实时定量PCR测定干扰效果。以8 Gy X射线照射转染CRNDE shRNA后的HT-29细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡水平。平板克隆实验检测放射敏感性。生物信息学软件预测CRNDE与miR-384有互补结合位点,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将CRNDE shRNA和miR-384 inhibitor共转染至HT-29细胞中,以8 Gy剂量照射处理,MTT和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡变化。结果CRNDE shRNA能够降低HT-29细胞中CRNDE表达水平(1.00±0.08 vs.0.42±0.06,t=10.051,P<0.05)。CRNDE shRNA和放射均可以抑制HT-29细胞增殖并诱导细胞凋亡,并且二者联合具有协同作用[凋亡率:(2.27±0.13)%、(23.58±2.35)%、(26.91±2.81)%、(36.84±3.24)%,F=24.66,P<0.05;吸光度(A)值:0.45±0.06、0.30±0.02、0.28±0.03、0.20±0.02,F=106.21,P<0.05]。CRNDE shRNA转染后可以提高HT-29细胞放射敏感性,放射增敏比为1.374。CRNDE靶向负调控miR-384表达。miR-384 inhibitor能够拮抗CRNDE shRNA对放射处理的结直肠癌细胞增殖抑制和凋亡促进的作用。结论下调LncRNA CRNDE表达可增强结直肠癌细胞的放射敏感性,其作用机制与靶向负调控miR-384表达有关。

CircKIF4A靶向调控miR-384表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨circKIF4A对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响及其对miR-384的调控作用机制。方法采用q RT-PCR法检测卵巢癌组织与癌旁组织中circKIF4A、miR-384的表达量;分别将si-NC、sicircKIF4A、miR-NC、miR-384 mimics、si-circKIF4A与anti-miR-NC、si-circKIF4A与anti-miR-384转染入SKOV3细胞;采用q RT-PCR法检测SKOV3细胞中circKIF4A、miR-384的表达量;采用MTT实验与流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡能力;双荧光素酶报告实验检测circKIF4A与miR-384的靶向关系。结果与癌旁组织比较,卵巢癌组织中circKIF4A的表达水平升高[(1.00±0.06),(4.28±0.32)](t=62.915, P <0.05),miR-384的表达水平降低[(1.00±0.05),(0.43±0.03)](t=61.047, P <0.05);转染si-circKIF4A后SKOV3细胞OD值降低[(0.75±0.05),(0.41±0.03)](t=17.493, P <0.05),凋亡率升高[(6.36±0.53)%,(23.19±2.21)%](t=22.216,P <0.05);转染miR-384 mimics后SKOV3细胞OD值降低[(0.73±0.05),(0.47±0.04)](t=12.182, P <0.05),凋亡率升高[(7.53±0.41)%,(19.11±1.06)%](t=30.567, P <0.05);双荧光素酶报告实验证实circKIF4A能够吸附miR-384,并可充当miR-384的海绵分子;共转染si-circKIF4A与anti-miR-384后SKOV3细胞OD值升高[(0.40±0.04),(0.65±0.03)](t=15.000, P <0.05),凋亡率降低[(25.20±2.21)%,(10.37±0.86)%](t=18.761, P <0.05)。结论抑制circKIF4A表达可负向调控miR-384的表达从而抑制卵巢癌细胞增殖及诱导细胞凋亡。

微小RNA-384靶向NK细胞表面受体NKG2A及STAT3蛋白对胃癌细胞生物学行为的作用机制

目的:探究微小RNA-384靶向NK细胞表面受体NKG2A及STAT3表达对胃癌细胞生物学行为的作用机制。方法:选取滕州市中心人民医院2017年4月至2020年3月已确诊的46例胃癌患者癌组织与癌旁组织标本进行研究。胃癌细胞分为胃癌组(胃癌细胞组)、对照组(转染NC组)、转染组(转染miRNA-384组)。PT-PCR检测胃癌细胞miR-384、NKG2A mRNA水平。MTT检测细胞增殖。流式细胞仪检测细胞凋亡。Western blot检测STAT3、Survivin蛋白水平。双荧光酶报告检测miR-384、NKG2A靶向关系。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-384表达降低、NKG2A表达升高(P<0.05)。与转染miR-384-NC组相比,转染miR-384组NK细胞增殖率随着时间延长而升高,CD16+、CD56+阳性率显著升高(P<0.05),提示转染miR-384后,可促进NK细胞增殖。胃癌组与对照组相比各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,转染组miR-384、凋亡率升高,NKG2A表达、增殖率、STAT3、Survivin表达降低(P<0.05)。NKG2A与STAT3表达呈正相关(r=0.327,P=0.003);NKG2A与Survivin表达呈正相关(r=0.415,P<0.001);STAT3与Survivin呈正相关(r=0.351,P=0.001)。转染miR-384后野生型胃癌细胞中NKG2A活性及STAT3表达降低(P<0.05),突变型胃癌细胞中NKG2A及STAT3表达无明显变化(P>0.05),表明NKG2A及STAT3是miR-384的靶基因。结论:miR-384通过靶向NK细胞表面受体NKG2A及STAT3表达,降低Survivin活性,促进胃癌细胞凋亡并抑制其增殖。

基于LncRNA MIAT/miR-384-5p研究九龙藤黄酮抑制自噬抗心肌缺氧损伤的作用机制

目的 基于长链非编码RNA(long non coding RNA,LncRNA)心肌梗死相关转录本(myocardial infarction associated transcript,MIAT)/miR-384-5p探讨九龙藤黄酮(Bauhinia championii flavones,BCF)抑制自噬抗心肌缺氧损伤的作用及机制。方法 培养H9c2心肌细胞及敲低LncRNA MIAT稳转株,建立心肌细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型模拟心肌缺血缺氧,给予BCF预处理;选取SD雄性大鼠,沉默miR-384-5p基因,建立急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)模型,给予BCF预处理。以qRT-PCR法检测LncRNA MIAT、miR-384-5p及自噬相关基因表达;采用双荧光素酶报告基因实验及RNA反义纯化(RNA antisense purification,RAP)实验验证LncRNA MIAT与miR-384-5p的靶向关系;采用ELISA法检测细胞上清液及大鼠血清中肌钙蛋白-I(cardiac troponin-I,c Tn-Ⅰ)水平;采用CCK-8法检测细胞活力;采用透射电镜观察自噬小体数量;以自噬双标腺病毒Ad-mRFP-GFP-LC3感染细胞检测自噬流;采用TTC染色法检测大鼠心肌梗死面积;采用Western blotting法检测自噬相关蛋白表达。结果 与OGD组比较,BCF能够下调LncRNA MIAT并上调miR-384-5p基因表达(P<0.05、0.01),提高心肌细胞活力(P<0.01),降低c Tn-I水平(P<0.001),下调Beclin1、Cathepsin D、LC3基因及蛋白表达(P<0.05、0.01),减少自噬小体数量(P<0.01),减轻自噬流(P<0.01)。双荧光素酶报告基因及RAP实验结果显示,LncRNA MIAT靶向负调控miR-384-5p表达。敲低LncRNA MIAT可抑制自噬,减轻心肌缺氧损伤;与单纯BCF预处理相比,敲低LncRNA MIAT可显著增强BCF抑制自噬和保护心肌的作用(P<0.05、0.01、0.001)。与AMI+BCF组比较,沉默miR-384-5p后给予BCF处理,大鼠心肌梗死面积显著增加(P<0.01),血清中c Tn-I水平显著升高(P<0.01),心脏组织中自噬相关基因及蛋白表达均显著上调(P<0.01),心肌缺血损伤加重。结论 BCF通过LncRNA MIAT/mi R-384-5p抑制自噬,从而减轻心肌缺氧损伤。

杭白菊总黄酮通过下调miR-384-5p抑制MPP^(+)诱导的SK-N-SH凋亡及氧化应激

目的探讨杭白菊总黄酮对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^(+))诱导的人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)凋亡和氧化应激的影响及可能机制。方法利用2.5 mmol/L MPP^(+)诱导SK-N-SH细胞建立细胞损伤模型,MPP^(+)诱导SK-N-SH细胞的同时加入0.1、0.2、0.4 mg/mL杭白菊总黄酮或(和)转染miR-384-5p模拟物(mimics),将加入杭白菊总黄酮的SK-N-SH细胞分为对照组(正常培养)、MPP^(+)组、MPP^(+)+杭白菊总黄酮低剂量(0.1 mg/mL)组、MPP^(+)+杭白菊总黄酮中剂量(0.2 mg/mL)组和MPP^(+)+杭白菊总黄酮高剂量(0.4 mg/mL)组,将转染miR-384-5p mimics的SK-N-SH细胞分为MPP^(+)+miR-384-5p组、MPP^(+)+杭白菊总黄酮组和MPP^(+)+杭白菊总黄酮+miR-384-5p组。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞中活化的半胱天冬酶-3(Cleavedcaspase3)蛋白表达,相应试剂盒检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平、细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,RT-qPCR检测miR-384-5p表达。结果与对照组比较,MPP^(+)组SK-N-SH细胞光密度(OD)值和SOD活性降低,细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、LDH漏出量、细胞中MDA和miR-384-5p表达升高,差异均有统计学意义(P均<0.05);与MPP^(+)组比较,MPP^(+)+杭白菊总黄酮低、中、高剂量组SK-N-SH细胞OD值和SOD活性依次升高,细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、LDH漏出量和细胞中MDA和miR-384-5p表达依次降低,差异均有统计学意义(P均<0.05),且杭白菊总黄酮呈剂量依赖性。与MPP^(+)组比较,MPP^(+)+miR-384-5p组SK-NSH细胞OD值、SOD活性降低,细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、LDH漏出量和MDA含量升高,差异均有统计学意义(P均<0.05);与MPP^(+)+杭白菊总黄酮组比较,MPP^(+)+杭白菊总黄酮+miR-384-5p组SK-N-SH细胞OD值、SOD活性降低,细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、LDH漏出量、MDA含量升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论杭白菊总黄酮可靶向下调miR-384-5p来抑制MPP^(+)诱导的SK-N-SH细胞凋亡和氧化应激。

靶向Notch信号通路与内耳发育相关microRNA的筛选及microRNA-384-5p的实验分析

目的筛选内耳中靶向调控Notch信号通路的关键microRNA,验证其对Notch信号通路的调控作用。方法构建Notch信号通路相关基因与microRNA相互作用网络,筛选核心基因并提取Core-Notch子网络,再通过拓扑学分析与GO分析筛选对Notch信号通路具有调控作用的关键microRNA,并在体内、外水平进行验证。结果以筛选的microRNA-384-5p(miR-384-5p)为研究对象,预测其对Notch信号通路具有较强调控作用。实验结果显示,miR.384-5p在小鼠脑与耳蜗组织中特异性表达;miR-384-5p-mimic转染HeLa细胞后,Notch1的表达水平显著下调;双荧光素酶报告基因检测进一步验证了miR-384-5p对Notch信号通路中Notch1和Dll4的负调控作用。结论基于构建的Core-Notch网络筛选内耳发育相关的microRNA,筛选出来的miR-384-5p分子可靶向调控Notch信号通路,可作为潜在的毛细胞修复的干预靶点。