miR-143和miR-520d-5p在胃癌组织中的异常表达

目的应用MicroRNAs(miRNAs)芯片技术筛选胃癌组织中差异表达的miRNAs,研究与胃癌相关的miRNAs。方法从3对手术切除的胃和相配对的正常胃组织中提取总RNA,miRNA芯片检测miRNA表达情况,然后在47例配对的胃癌和正常胃组织中,用Real-time RT-PCR(Taqman)对部分差异表达miRNA进行验证。结果芯片结果显示:与配对的正常胃组织相比,有62个miRNAs在胃癌中异常表达,其中42个miRNA高表达,20个miRNA低表达。用Real-time RT-PCR(Taqman)验证显示:miR-143在胃癌组织中表达显著降低(P=0.002 9);miR-520d-5p在胃癌组织中表达显著提高(P=0.032)。结论miR-143和miR-520d-5p可能参与了胃癌的发生过程。

苍耳亭通过调控LOXL1-AS1miR-520d-5p轴对白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨苍耳亭对白血病细胞的抗癌作用及其机制是否与调控长链非编码RNA(lncRNA)类赖氨酰氧化酶1反义RNA1(LOXL1-AS1)和微小RNA(miR)-520d-5p表达有关。方法 按转染细胞分组:对照组、苍耳亭6μmol/L组、苍耳亭20μmol/L组、苍耳亭60μmol/L组、si-NC组、si-LOXL1-AS1组、苍耳亭+pcDNA-LOXL1-AS1组;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。实时定量PCR(RT-qPCR)检测LOXL1-AS1和miR-520d-5p表达;蛋白质印迹法检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl相关x蛋白(Bax)蛋白表达。分别转染LOXL1-AS1小干扰RNA、LOXL1-AS1过表达载体至K-562细胞中,通过CCK-8法、流式细胞术、蛋白质印迹法分析干扰LOXL1-AS1表达或过表达LOXL1-AS1联合苍耳亭对K-562细胞增殖、凋亡以及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。双荧光素酶报告实验分析LOXL1-AS1和miR-520d-5p相互作用。结果 苍耳亭处理后K-562细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达、miR-520d-5p表达显著升高(均P<0.05),Bcl-2蛋白表达、LOXL1-AS1表达显著降低(均P<0.05)。干扰LOXL1-AS1表达后K-562细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达、miR-520d-5p表达显著升高(均P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。过表达LOXL1-AS1明显减弱苍耳亭处理对K-562细胞细胞增殖、凋亡以及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。LOXL1-AS1与miR-520d-5p直接结合。结论 苍耳亭可抑制白血病细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能与抑制LOXL1-AS1/miR-520d-5p轴有关。

miR-495-3p、miR-181d-5p在宫颈癌患者中的表达及临床意义

目的探讨miR-495-3p、miR-181d-5p在宫颈癌及宫颈癌前病变组织中的表达差异及对宫颈癌诊断的价值。方法收集2020年6月—2022年12月河北中石油中心医院收治的30例宫颈低级别鳞状上皮内病变(CINⅠ级组)、30例宫颈高级别鳞状上皮内瘤变(CINⅡ~Ⅲ级组)、50例宫颈癌(宫颈癌组)患者的临床资料及宫颈组织标本。采用免疫组化法检测各组宫颈组织中miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达情况,比较各组miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达率;采用RT-qPCR法检测宫颈癌组患者癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达量,分析miR-495-3p和miR-181d-5p表达量与宫颈癌患者临床病理特征的关系、miR-495-3p和miR-181d-5p对宫颈癌的诊断价值及二者在宫颈癌组织中表达的相关性。结果宫颈癌组miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达率均明显低于CINⅠ级组及CINⅡ~Ⅲ级组(P均<0.05)。宫颈癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达量与FIGO分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关(P均<0.05),FIGO分期越高、浸润越深二者表达量越低;miR-181d-5p表达量与分化程度有关(P<0.05),分化程度越高miR-181d-5p表达量越低。miR-495-3p、miR-181d-5p联合检测对宫颈癌的诊断价值高于miR-495-3p、miR-181d-5p单一检测(P=0.001)。宫颈癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达呈正相关。结论miR-495-3p、miR-181d-5p表达量与宫颈癌患者的FIGO分期、浸润深度、淋巴结转移情况相关,两者表达之间具有一定相关性,二者联合检测有助于宫颈癌的诊断。

miR-30d-5p对宫颈癌细胞生长和转移的影响

目的探究miR-30d-5p在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌细胞的恶性生物学行为的影响。方法qRT-PCR检测宫颈癌组织、癌旁组织和正常宫颈细胞、宫颈癌细胞中miR-30d-5p的表达。将模拟物阴性对照(mimic NC)和miR-30d-5p模拟物(miR-30d-5p mimic)转染至SiHa细胞,采用qRT-PCR检测miR-30d-5p的转染效率;CCK-8和细胞克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕闭合实验和Transwell法分别检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测细胞凋亡和侵袭相关蛋白的表达。结果与癌旁组织相比,宫颈癌组织中miR-30d-5p的表达显著下调(P<0.01)。与Ect1/E6E7细胞相比,宫颈癌细胞系中miR-30d-5p的表达水平均显著降低(P<0.01)。miR-30d-5p的过表达抑制了SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡(P<0.01)。此外,miR-30d-5p的过表达显著下调了Bcl-2、N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平(P<0.01),显著上调了Bax、cleaved caspase-3和E-钙黏蛋白的表达水平(P<0.01)。结论miR-30d-5p在人宫颈癌组织及相关宫颈癌细胞系中显著下调,miR-30d-5p通过抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,在体外对宫颈癌细胞起抑癌作用,提示miR-30d-5p可能是宫颈癌患者诊断和治疗的潜在新靶点。

牵张刺激下牙周膜细胞外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用

目的探索牵张加载下牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)外泌体对成骨细胞分化的影响,以及牵张加载下PDLCs外泌体在力相关牙周组织改建中的调控作用。方法对体外培养人PDLCs施加20%牵张应变后,提取上清中的外泌体与成骨细胞共培养,检测成骨细胞分化情况,并探索外泌体中发挥调控作用的miRNA。结果牵张加载下PDLCs分泌的外泌体可上调成骨细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、转录因子Osterix(Osx)、I型胶原蛋白(type I collagen,COL-1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP 2)等成骨相关因子表达,促进细胞成骨向分化。牵张加载下PDLCs外泌体差异表达miRNA中,miRNA-181d-5p表达量上调达107倍,将其转染成骨细胞后,成骨细胞中ALP、Osx、Col-1、Runx2、Ocn和BMP2等成骨相关因子表达亦增加。结论本研究初步揭示了牵张加载下PDLCs外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用,对于明确力相关牙周组织改建中的信号通路具有重要科学意义。

血清外泌体miR-30d-5p靶向RHOB在三氯乙烯药疹样皮炎中的作用

目的检测三氯乙烯药疹样皮炎(OMDT)患者血清外泌体中miR-30d-5p的表达水平及其与肝功能的相关性,再对miR-30d-5p进行生信分析并验证下游靶基因RHOB。方法收集6例OMDT患者和6例健康对照者血清样本提取血清外泌体。透射电镜、纳米粒子跟踪分析以及Western blot法对外泌体进行鉴定后提取miRNA,检测其中miR-30d-5p表达水平并与肝功能作相关性分析,用miRWalk及miRBD数据库预测miR-30d-5p的靶基因,进行功能聚类和途径富集分析,最后通过双荧光素酶报告基因实验验证靶基因RHOB。结果6例OMDT患者在发病高峰期时血清外泌体中miR-30d-5p表达水平明显降低(P<0.05),并且与肝功能指标丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰胺基转移酶水平均呈负相关(相关系数分别为:r_(s)=-0.943,P=0.005;r_(s)=-0.886,P=0.019;r_(s)=-0.886,P=0.019)。生信分析及双荧光素酶报告基因实验显示RHOB是miR-30d-5p的直接靶基因。结论OMDT患者血清外泌体miR-30d-5p表达降低,与肝功能指标呈负相关,并且可能通过靶向RHOB参与三氯乙烯所致肝损伤过程。

LncRNA MALAT1通过调控miR-181d-5p对脂多糖诱导的库普弗细胞增殖活性和炎性因子表达的影响

目的探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1(LncRNA MALAT1)对脂多糖(LPS)诱导的库普弗细胞(kupffer cells,KCs)存活和炎性因子表达的影响及其可能作用机制。方法采用LPS诱导KCs建立细胞损伤模型,随机分组为对照(Con)组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-MALAT1组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-181d-5p组、LPS+si-MALAT1+anti-miR-NC组、LPS+si-MALAT1+anti-miR-181d-5p组;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测LncRNA MALAT1、miR-181d-5p的表达量;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖活性;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-6、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平;双荧光素酶报告实验检测LncRNA MALAT1与miR-181d-5p的靶向关系。结果与Con组比较,LPS组LncRNA MALAT1的表达量升高(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平升高(P<0.05),miR-181d-5p的表达量降低(P<0.05),细胞增殖活性降低(P<0.05)。与LPS+si-NC组比较,LPS+si-MALAT1组细胞增殖活性升高(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平降低(P<0.05)。LncRNA MALAT1可负向调控miR-181d-5p的表达;与LPS+miR-NC组比较,LPS+miR-181d-5p组细胞增殖活性升高(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平降低(P<0.05)。与LPS+si-MALAT1+antimiR-NC组比较,LPS+si-MALAT1+anti-miR-181d-5p组细胞增殖活性降低(P<0.05),IL-6、IL-12、TNF-α的水平升高(P<0.05)。结论干扰LncRNA MALAT1表达可通过促进miR-181d-5p表达而促进LPS诱导的KCs存活及抑制细胞炎性因子表达。

环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)通过调控miR-181d-5p/miR-199a-5p促进口腔鳞状细胞癌进展

目的:探讨环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞生物学功能中的作用及机制。方法:收集30例OSCC患者的临床组织,采用实时定量PCR检测circFAT1、miR-181d-5p及miR-199a-5p在OSCC组织和细胞中的表达。通过StarBase和双荧光素酶报告基因实验验证miR-181d-5p/miR-199a-5p与circFAT1的靶向关系。利用CCK-8、Transwell、流式细胞术检测circFAT1-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴对于OSCC细胞活力、迁移、侵袭、凋亡和周期的影响。采用免疫印迹法结合LY294002处理检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果:在OSCC中circFAT1表达升高,miR-181d-5p、miR-199a-5p表达下降(P<0.001)。circFAT1可以同时靶向miR-181d-5p和miR-199a-5p(P<0.01)。沉默circFAT1、过表达miR-181d及miR-199a-5p抑制了OSCC细胞活力、迁移、侵袭和周期进展、诱导凋亡,同时抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活;过表达circFAT1、抑制miR-181d-5p及miR-199a-5p则发挥相反作用(P<0.05)。miR-181d-5p、miR-199a-5p可部分逆转circFAT1对OSCC细胞生物学功能的影响(P<0.05)。LY294002预处理逆转了过表达circFAT1对PI3K/Akt/mTOR通路和细胞活力的影响(P<0.05)。结论:circFAT1通过调控miR-181d-5p和miR-199a-5p促进OSCC细胞恶性进展。

血清miR-520d-3p和miR-627检测在创伤性脑损伤诊断及预后监测中的临床价值

目的检测创伤性脑损伤(TBI)患者血清miR-520d-3p和miR-627的表达水平,探讨其作为TBI诊断及预后判断指标的价值。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测67例轻度创伤性脑损伤(mTBI)患者(mTBI组)、67例重度创伤性脑损伤(sTBI)患者(sTBI组)及67例健康对照者(健康对照组)血清miR-520d-3p和miR-627表达水平。采用格拉斯哥预后等级评分(GOS)进行预后评价,将GOS≤3分者纳入预后差组,GOS>3分者纳入预后好组。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估miR-520d-3p和miR-627对TBI的诊断效能。结果与健康对照组相比,mTBI组和sTBI组患者血清miR-520d-3p和miR-627表达水平明显升高(P<0.05),且sTBI组患者血清miR-520d-3p和miR-627表达水平明显高于mTBI组(P<0.05);TBI患者治疗后,miR-520d-3p和miR-627表达水平有所下降,差异有统计学意义(P<0.05);预后差组的miR-520d-3p和miR-627表达水平明显高于预后好组(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清miR-520d-3p和miR-627区分mTBI患者与健康对照者的曲线下面积(AUC)分别为0.866(95%CI:0.800~0.933,P<0.05)和0.832(95%CI:0.763~0.903,P<0.05),区分sTBI患者与健康对照者的AUC分别为0.913(95%CI:0.813~0.965,P<0.05)和0.890(95%CI:0.839~0.946,P<0.05),区分mTBI患者与sTBI患者的AUC分别为0.622(95%CI:0.527~0.718,P<0.05)和0.651(95%CI:0.558~0.743,P<0.05)。结论血清miR-520d-3p和miR-627对诊断TBI具有一定的临床应用价值,有望成为新的潜在标志物。

miR-30d-5p对转化生长因子-β1诱导肾小管上皮细胞生长及迁移的影响

目的 miR-30d-5p是否影响转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞生长及迁移尚不清楚。文中旨在研究miR-30d-5p对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞生长和迁移的影响及机制。方法 TGF-β1处理肾小管上皮细胞HK-2,分为:空白组(未经任何处理)、TGF-β1组、miR-NC组(转染miR-30d-5p阴性对照miR-NC)、miR-30d-5p组(转染miR-30d-5p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-30d-5p阴性对照anti-miR-NC)、anti-miR-30d-5p组(转染anti-miR-30d-5p)、miR-30d-5p+pcDNA3.1组(转染miR-30d-5p与pcDNA3.1-BMP7阴性对照pcDNA3.1)、miR-30d-5p+pcDNA3.1-BMP7组(转染miR-30d-5p与pcDNA3.1-BMP7)、anti-miR-30d-5p+si-NC组(转染anti-miR-30d-5p与si-BMP7阴性对照si-NC)、anti-miR-30d-5p+si-BMP7组(转染anti-miR-30d-5p与si-BMP7)。除空白组外,其他各组经TGF-β1处理。qPCR检测miR-30d-5p的表达,Western blot检测P21和E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达, MTT检测细胞活性,Transwell检测细胞迁移,观察过表达miR-30d-5p或抑制miR-30d-5p对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响。生物信息学预测和双荧光素酶报告实验分析miR-30d-5p与骨形态发生蛋白7(BMP7)的靶向关系。评估其在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞细胞活性及迁移中的作用。结果 TGF-β1组肾小管上皮细胞的miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数较空白组明显升高(P<0.05),P21和E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。miR-30d-5p组肾小管上皮细胞miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数较miR-NC组明显增加(P<0.05),P21和E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较, anti-miR-30d-5p组肾小管上皮细胞的miR-30d-5p表达、生长率和迁移细胞数明显降低(P<0.05),P21和E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-30d-5p组WT-BMP7荧光素酶的活性、BMP7 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较,anti-miR-30d-5p组的BMP7 mRNA表达显著升高(P<0.05)。anti-miR-30d-5p+si-BMP7组肾小管上皮细胞的BMP7、P21和E-cadherin蛋白水平[(0.21±0.03)、(0.29±0.03)、(0.37±0.04)]较anti-miR-30d-5p+si-NC组[(0.71±0.05)、(0.53±0.04)、(0.63±0.05)]明显降低(P<0.05),生长率和迁移细胞数显著升高(P<0.05)。结论 miR-30d-5p通过靶向调控BMP7的表达促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞生长及迁移,为肾间质纤维化的机制研究提供了指导意义。

BSN-AS2竞争性结合miR-219a-5p影响NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡

目的:探讨BSN-AS2竞争性结合miR-219a-5p调控非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制。方法:qRT-PCR检测BSN-AS2和miR-219a-5p在NSCLC组织和细胞系中的表达;原位杂交FISH检测BSN-AS2和miR-219a-5p的信号强度;双荧光素酶报告基因检验miR-219a-5p靶向调控BSN-AS2;Transwell、CCK8和Tunel细胞凋亡分别检测BSN-AS2-miR-219a-5p轴对侵袭、迁移、增殖和凋亡的影响;构建NSCLC裸鼠皮下移植瘤模型进行验证BSN-AS2-miR-219a-5p轴的调控作用。结果:BSN-AS2在NSCLC组织和细胞系中高表达,miR-219a-5p为低表达,BSN-AS2竞争性结合miR-219a-5p;siBSN-AS2组抑制NCI-H520细胞侵袭、迁移和增殖,且促进细胞凋亡,而In-miR-219a-5p组促进NCI-H520细胞侵袭、迁移和增殖,抑制细胞凋亡,siBSN-AS2+In-miR-219a-5p组相比siBSN-AS2组促进了NCI-H520细胞侵袭、迁移和增殖,抑制细胞凋亡;BSN-AS2增加体内肿瘤细胞增殖和肿瘤生长,miR-219a-5p则能抑制。结论:BSN-AS2竞争性结合miR-219a-5p促进NSCLC细胞侵袭、迁移和增殖,且抑制凋亡,而干扰BSN-AS2-miR-219a-5p轴可能作为抗NSCLC的新靶点。

红景天苷通过调节miR-30d-5p表达减弱大鼠心肌细胞肥大的机制研究

[目的]研究红景天苷(salidroside,SAL)调控微小RNA(microRNA,miR)改善大鼠心肌肥大的机制。[方法]采用苯肾上腺素(phenylephrine,PE)刺激新生大鼠心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,以miR基因芯片筛选出3组细胞(正常对照组、模型组和SAL组)中有显著差异的miR,利用生物信息学方法和双荧光素酶报告基因确定靶基因。以Real-time PCR与Western blot分别检测靶基因mRNA及蛋白表达。在分别以SAL、候选miR模拟物和抑制物干预后,检测心肌细胞的表面积,分析靶基因和靶蛋白的表达。[结果]基因芯片结果表明,模型组与正常对照组有14种miR存在显著差异,SAL组与模型组有10种miR存在显著差异。模型组miR-30d-5p表达水平显著低于正常对照组和SAL组(P<0.05),而SAL组miR-30d-5p表达量与正常对照组无统计学差异(P>0.05)。生物信息学方法和双荧光素酶报告基因测定确定葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein78,GRP78)是miR-30d-5p的靶基因。SAL能够上调PE刺激诱导的肥大心肌细胞的miR-30d-5p水平,抑制心肌细胞表面积增大;miR-30d-5p模拟物能抑制心肌细胞GRP78蛋白表达,而miR-30d-5p抑制物的作用结果相反。[结论]miR-30d-5p具有抑制心肌肥大的作用,SAL可能通过增加心肌细胞中miR-30d-5p的表达,抑制GRP78 mRNA及蛋白表达,从而改善心肌肥大。

DLEU2靶向miR-30d-5p影响舌鳞癌细胞增殖和凋亡的分子机制

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)DLEU2对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞增殖及凋亡的影响及其可能的作用机制。方法利用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测TSCC组织及癌旁组织中DLEU2的表达水平。将pcDNA3.1-DLEU2、pcDNA3.1、si-DLEU2、si-NC分别转染入TSCC Tca8113细胞,pcDNA3.1-DLEU2与miR-30d-5p、miR-NC分别共转染入TSCC Tca8113细胞,采用qRT-PCR法验证转染效率。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及流式细胞仪分别检测转染后各组细胞增殖及凋亡能力的改变。双荧光素酶报告检测DLEU2与miR-30d-5p的靶向调控作用。Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关x蛋白(Bax)蛋白表达。结果相对于癌旁组织,TSCC组织中DLEU2的表达水平显著下调(P<0.05)。Tca8113细胞中转染pcDNA3.1-DLEU2能显著上调DLEU2表达水平,降低细胞增殖能力,增强细胞凋亡能力,上调p21、Bax表达,下调CyclinD1、Bcl-2表达(均P<0.05);双荧光素酶报告基因检测显示miR-30d-5p是DLEU2的直接靶点;与pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC组比较,Tca8113细胞中共转染pcDNA3.1-DLEU2与miR-30d-5p后,增强细胞增殖能力,降低细胞凋亡能力,抑制p21、Bax表达,而促进CyclinD1、Bcl-2表达(均P<0.05)。结论LncRNA DLEU2可通过抑制miR-30d-5p表达进而抑制TSCC细胞增殖及诱导细胞凋亡。

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性;实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达;利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因,并进行GO和KEGG富集分析;使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体,并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞,进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系,测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物(miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics)、抑制物(miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor)、阴性对照(NC)及其靶基因的干扰siRNA(Gene-siRNA),转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后,分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况,油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】保守性分析结果表明,miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性;miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示,miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达;靶基因预测结果表明,miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶(GPD2)和环腺苷酸反应元件(CREB1);GO和KEGG功能富集分析发现,miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成,调节脂肪细胞分化,且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<-87.8 kJ/mol;双荧光素酶报告基因试验结果表明,转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性(P<0.01),但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明,与未分化脂肪细胞(0 d)相比,miR-181a表达量在分化的第4天显著升高(P<0.05),到第6天达到极显著差异(P<0.01);miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高(P<0.01)。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果,与NC组相比,mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升(P<0.01),inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降(P<0.01);mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降(P<0.01),inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升(P<0.01);mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升(P<0.05;P<0.01),inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降(P<0.05);油红O染色结果表明,与NC组相比,mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加,inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3′-UTR区域序列,降低GPD2和CREB1基因的表达,促进猪前体脂肪细胞成脂分化。

长链非编码RNA PVT1和miR-30d-5p在肝内胆管癌组织中的表达及其与预后相关性分析

目的:分析肝内胆管癌(ICC)组织中长链非编码RNA PVT1(lncRNA PVT1)和miR-30d-5p的表达,探讨其与ICC患者临床病理因素及预后的关系。方法:收集2012年3月至2015年9月间经手术切除的47例ICC组织和相应癌旁组织(≥5 cm)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测组织中lncRNA PVT1、miR-30d-5p表达水平,分析二者表达与临床病理因素及3年总生存率(OS)的关系。结果:ICC组织中lncRNA PVT1表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05),miR-30d-5p表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。lncRNA PVT1表达与ICC患者肿瘤直径、组织分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05),miR-30d-5p表达与ICC患者组织分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。ICC组织中lncRNA PVT1表达与miR-30d-5p表达呈负相关(P<0.05)。lncRNA PVT1低表达者3年OS明显高于高表达者(P<0.05),miR-30d-5p高表达者3年OS显著高于低表达者(P<0.05)。组织分化程度、TNM分期、lncRNA PVT1表达、miR-30d-5p表达均是影响ICC患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:ICC组织中lncRNA PVT1高表达、miR-30d-5p低表达,二者表达与ICC患者组织分化程度、TNM分期及预后有关。

基于生物信息学分析miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍发病机制中的作用

目的采用生物信息学方法分析miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍(ADHD)发病机制中的作用。方法通过TargetScan7.2、miRDB和miRTarBase数据库预测miR-30d-5p的靶基因,利用Cytoscape 3.7.1软件中的ClueGO插件对靶基因进行GO和KEGG富集分析,同时通过Cytoscape 3.7.1软件中的STRING插件构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选出核心基因,通过与ADHD gene数据库中已验证的ADHD相关基因对比,分析miR-30d-5p在ADHD中的作用和意义。结果GO富集显示miR-30d-5p靶基因定位到核质、细胞内细胞器、轴突、细胞膜等细胞结构,并在神经系统中广泛参与到神经元发育、分化、神经元发生的调节、神经元投射发育、顺式调控区结合及顺式调控区序列特异性DNA结合等生物过程。KEGG富集显示miR-30d-5p靶基因显著富集在FoxO信号通路、轴突导向、海马长时程增强和神经营养信号通路。NOTCH1、KRAS、SIRT1、MAPK8、SOCS3、NEDD4、SKP2、BDNF、NEDD4L、SOCS1为miR-30d-5p预测靶基因的PPI网络中的核心基因。与ADHD gene数据库对比结果显示miR-30d-5p预测靶基因有33个基因与ADHD相关,且33个基因中含有预测核心基因BDNF。结论miR-30d-5p通过靶向调控BDNF基因参与ADHD发生发展的过程,miR-30d-5p有潜力成为ADHD诊疗相关的靶点。

miR-520a-5p靶向TGR5调控H9c2细胞中高糖引起的心肌肥大

目的探讨高糖引起H9c2细胞心肌肥大的潜在机制。方法通过高糖处理H9c2细胞后,检测其表面积大小以及心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平。通过高通量测序检测高糖处理H9c2细胞表达的差异mi RNA。过表达差异mi RNA后检测心脏肥大标志物ANP的表达水平。通过mi RDB在线分析mi RNA的潜在底物。结果高糖可使心肌细胞H9c2的大小增加(P<0.05)、表面积增加(P<0.05)。高糖处理后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均上升(P<0.05)。敲低mi R-520a-5p后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均下降(P<0.05)、心肌细胞H9c2表面积减少(P<0.05)。过表达mi R-520a-5p后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均上升(P<0.05)、心肌细胞H9c2表面积增加(P<0.05)。mi R-520a-5p靶向TGR5的3端非编码区(P<0.05)。过表达mi R-520a-5p后,TGR5表达水平下降。敲低TGR5后,TGR5表达水平上升。敲低TGR5后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均上升(P<0.05)、心肌细胞H9c2表面积增加(P<0.05)。过表达TGR5后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均下降(P<0.05)、心肌细胞H9c2表面积减少(P<0.05)。结论高糖处理后,mi R-520a-5p的表达水平上升,mi R-520a-5p通过靶向TGR5 m RNA的3端非编码区后降解了TGR5 mRNA,降低了TGR5的蛋白水平,随后引起了H9c2细胞的心肌肥大。

长链非编码RNA LINC00641通过miR-181d-5p/FOXP1调控结肠癌细胞增殖

目的分析长链非编码RNA(LncRNA)LINC00641在结肠癌细胞HCT-116中的表达特征,探讨LINC00641通过微小RNA-181d-5p(miR-181d-5p)/叉头框蛋白P1(FOXP1)对细胞增殖的调控作用。方法选择人结肠癌细胞系HCT-116、人正常结肠上皮细胞系CCD841,应用实时荧光定量PCR检测LINC00641和miR-181d-5p的表达。将未进行转染的HCT-116细胞设为空白对照组,并构建转染pc-DNA3.1的空载体转染组、转染pc-DNA3.1-LINC00641的pc-DNA-LINC00641组、转染pc-DNA3.1-LINC00641-siRNA的si-LINC00641组,转染miR-181d-5p inhibitor的miR-181d-5p inhibitor组、转染miR-181d-5p mimic的miR-181d-5p mimic组、转染siRNA-FOXP1的si-FOXP1组。应用CCK-8实验检测细胞增殖活性,应用Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,应用双荧光素酶报告基因实验观察LINC00641和miR-181d-5p、miR-181d-5p和FOXP1的靶向关系。结果结肠癌细胞系中LINC00641的表达量明显低于正常结肠上皮细胞系,miR-181d-5p的表达量明显高于正常结肠上皮细胞系。与空白对照组和空载体转染组比较,pc-DNA-LINC00641组的细胞增殖活性明显降低,si-LINC00641组细胞增殖活性明显增高。双荧光素酶报告基因实验显示LINC00641和miR-181d-5p、miR-181d-5p和FOXP1具有靶向关系。挽救实验显示沉默FOXP1可以部分逆转过表达LINC00641和沉默miR-181d-5p对细胞增殖的抑制作用及PCNA的低表达状态。结论结肠癌细胞系中LINC00641的表达下调,LINC00641通过miR-181d-5p/FOXP1途径抑制结肠癌细胞的增殖。

调控miR-181d-5p表达对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响

目的探究miR-181d-5p对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭影响及对细胞硫酰化限速酶(sulfation rate-limiting enzyme,PAPSS2)/蛋白聚糖(proteoglycans,VCAN)信号通路的影响。方法细胞学实验:人宫颈癌细胞Hela细胞分为对照组、NC组和miR-181d-5p组,MTT、流式细胞技术及Transwell实验分别检测各组细胞增殖、凋亡和侵袭能力,Western blot检测各组PAPSS2和VCAN蛋白表达水平。裸鼠荷瘤实验:20只SPF级裸鼠随机分为对照组(n=10)和miR-181d-5p组(n=10),分别接种野生型细胞和转染miR-181d-5p细胞,模型建立后每3 d测量1次小鼠肿瘤体积,连续测量21 d,于实验终点测量肿瘤质量和体积。结果细胞学实验表明:与对照组和NC组比较,miR-181d-5p组细胞增殖能力显著降低、细胞凋亡比例显著增加、细胞侵袭能力显著降低、PAPSS2,VCAN表达水平显著下调(P<0.05),NC组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。裸鼠荷瘤实验表明:miR-181d-5p组小鼠肿瘤生长受到显著抑制,肿瘤质量显著低于对照组(P<0.05)。结论miR-181d-5p可以抑制人宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力,促进细胞凋亡,其机制可能与PAPSS2/VCAN信号通路活性的抑制相关。

上调lncRNA OIP5-AS1通过靶向miR-181d-5p减少脂多糖诱导的心肌细胞损伤

目的探讨长链非编码(long non-coding RNA,lncRNA)OIP5-AS1在脂多糖诱导心肌细胞损伤中的作用及内在机制。方法将大鼠原代心肌细胞分为两组,分别感染空载慢病毒(对照组)和载有OIP5-AS1序列的慢病毒(实验组),实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证感染效率。对照组和实验组细胞分别滴加100μl浓度为10μmol/L脂多糖诱导心肌细胞损伤,采用ELISA法检测培养基中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的表达水平。采用CCK-8法和流式细胞术分别检测OIP5-AS1对大鼠原代心肌细胞的活力和凋亡的影响。生物信息学技术和双荧光素酶报告基因实验分别预测和验证OIP5-AS1的靶基因。qRT-PCR检测靶基因的表达。Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。结果与对照组比较,实验组细胞中OIP5-AS1表达显著增加(P<0.01)。脂多糖处理后,与对照组相比,实验组培养基中TNF-α和IL-1β的表达明显降低(均P<0.05)。与对照组相比,实验组细胞活力明显增加(P<0.01),细胞的凋亡明显降低(P<0.01)。OIP5-AS1的靶基因可能是miR-181d-5p,OIP5-AS1可与miR-181d-5p互补配对(P<0.01)。与对照组相比,实验组细胞中miR-181d-5p的表达明显降低(P<0.01)。与对照组相比,实验组细胞中Bcl-2蛋白表达增加,Bax和Caspase-3蛋白表达降低。结论上调OIP5-AS1可通过靶向抑制miR-181d-5p表达,减少脂多糖诱导的心肌细胞损伤。