本实验旨在探究Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用。选取4~6周龄的雌性C57BL/6J小鼠,注射孕马血清促性腺激素(PMSG)48 h后采集卵母细胞并随机分为对照组和Mic60抑制组(包括50、100、130、150μmol/L组,Miclxin组为130μmol/L)。卵母...本实验旨在探究Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用。选取4~6周龄的雌性C57BL/6J小鼠,注射孕马血清促性腺激素(PMSG)48 h后采集卵母细胞并随机分为对照组和Mic60抑制组(包括50、100、130、150μmol/L组,Miclxin组为130μmol/L)。卵母细胞体外培养16 h后,通过免疫荧光染色检测纺锤体形态、ROS水平、线粒体分布和质量,利用qPCR检测抗氧化基因表达、线粒体呼吸链亚基的表达、整合应激反应相关基因的表达。结果表明:与对照组相比,130μmol/L Mic60抑制剂会降低卵母细胞体外成熟率(78.29%vs.21.08%,P<0.01),并显著阻碍纺锤体的组装;与对照组相比,Miclxin组卵母细胞中的ROS水平升高(P<0.05),且Sod1(0.83 vs. 0.22)和Sod2(0.84 vs. 0.27)基因表达降低(P<0.05),线粒体分布异常比例升高(0.16 vs. 0.57,P<0.05),线粒体膜电位水平降低(1.61 vs. 1.05,P<0.05),ATP产生降低(1.16 vs. 0.79,P<0.05);Miclxin组卵母细胞线粒体呼吸链复合体亚基Ndufv2和Sdha表达降低(P<0.05),Cyc1表达升高(P<0.05),卵母细胞mtDNA拷贝数降低(19 324 vs. 9 066,P<0.05);与对照组相比,Miclxin组卵母细胞Oma1、Dele1、Eif2ak1、eIF2α基因表达上调(P<0.05),触发了整合应激反应(Integrated Stress Response,ISR)并上调了ISR主要效应因子Atf4、Atf5和Chop的表达(P<0.05)。可见,抑制Mic60会通过损害线粒体功能并触发ISR影响卵母细胞体外成熟效果。展开更多
目的线粒体的功能取决于线粒体的膜系统,而线粒体内膜的形态由近期发现的线粒体接触位点复合物(mitochondrial contact site and crista organizing system,MICOS)所调节,MICOS复合物的突变可改变嵴的形成,导致线粒体功能障碍。本研究...目的线粒体的功能取决于线粒体的膜系统,而线粒体内膜的形态由近期发现的线粒体接触位点复合物(mitochondrial contact site and crista organizing system,MICOS)所调节,MICOS复合物的突变可改变嵴的形成,导致线粒体功能障碍。本研究采用慢病毒shRNA靶向敲低MICOS复合物亚基蛋白-线粒体内膜蛋白Mic19及Mic60表达,并研究敲低Mic19和Mic60对肝癌细胞生物学作用的影响。方法根据NCBI中的序列设计、构建并包装敲低Mic19及Mic60的重组慢病毒,收集被病毒上清感染后经嘌呤霉素筛选得到的肝癌HepG2阳性细胞,并以空白组、空载pLKO.1慢病毒质粒组作为对照。采用蛋白印迹法检测Mic19及Mic60蛋白的表达,以筛选敲低效率最高的稳定细胞株。采用MTT法、划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭情况,观察敲低Mic19及Mic60蛋白表达对肝癌细胞生物学行为的影响。结果 Mic19敲低组中蛋白相对表达量shRNA Mic19-1(0.579±0.042)和shRNA Mic19-2(0.524±0.111)均低于空白组(1.065±0.105)或空载组(1.07±0.092),差异有统计学意义,均P<0.01。Mic60敲低组蛋白相对表达量shRNA Mic60-1(0.172±0.107)、shRNA Mic60-2(0.269±0.027)明显低于空白组(1.065±0.105)或空载组(1.07±0.092),差异有统计学意义,均P<0.01。生长曲线表明,Mic19敲低组至感染第36h时的吸光度(A)值低于对照组,均P<0.05;Mic60敲低组至感染第12h时的A值显著低于对照组,P<0.01。划痕实验表明,至第48hMic19敲低组细胞迁移距离为(286.8±38.97)μm,Mic60敲低组细胞迁移距离为(214.6±41.64)μm,与空白组(500.8±25.6)μm或空载组(487.3±31.37)μm相比差异均有统计学意义,均P<0.01。在不铺胶的Transwell迁移实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(440.4±65.35)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(235.2±21.3)个/低倍视野,均少于空白组(574.8±36.4)或空载组(574±53.95)个/低倍视野,均P<0.01。在铺胶的侵袭实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(172.4±15.5)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(118.2±25.53)个/低倍视野,均少于对照组空白组(238.6±22.85)或空载组(227.8±22.27)个/低倍视野,差异有统计学意义,均P<0.01。结论重组慢病毒shRNA Mic19-2、shRNA Mic60-1可分别有效敲低HepG2细胞Mic19、Mic60的表达。慢病毒shRNA靶向敲低Mic19及Mic60表达可抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并为后续进一步研究线粒体内膜蛋白(Mic19、Mic60)对肝癌细胞发生发展的影响提供依据。展开更多
文摘本实验旨在探究Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用。选取4~6周龄的雌性C57BL/6J小鼠,注射孕马血清促性腺激素(PMSG)48 h后采集卵母细胞并随机分为对照组和Mic60抑制组(包括50、100、130、150μmol/L组,Miclxin组为130μmol/L)。卵母细胞体外培养16 h后,通过免疫荧光染色检测纺锤体形态、ROS水平、线粒体分布和质量,利用qPCR检测抗氧化基因表达、线粒体呼吸链亚基的表达、整合应激反应相关基因的表达。结果表明:与对照组相比,130μmol/L Mic60抑制剂会降低卵母细胞体外成熟率(78.29%vs.21.08%,P<0.01),并显著阻碍纺锤体的组装;与对照组相比,Miclxin组卵母细胞中的ROS水平升高(P<0.05),且Sod1(0.83 vs. 0.22)和Sod2(0.84 vs. 0.27)基因表达降低(P<0.05),线粒体分布异常比例升高(0.16 vs. 0.57,P<0.05),线粒体膜电位水平降低(1.61 vs. 1.05,P<0.05),ATP产生降低(1.16 vs. 0.79,P<0.05);Miclxin组卵母细胞线粒体呼吸链复合体亚基Ndufv2和Sdha表达降低(P<0.05),Cyc1表达升高(P<0.05),卵母细胞mtDNA拷贝数降低(19 324 vs. 9 066,P<0.05);与对照组相比,Miclxin组卵母细胞Oma1、Dele1、Eif2ak1、eIF2α基因表达上调(P<0.05),触发了整合应激反应(Integrated Stress Response,ISR)并上调了ISR主要效应因子Atf4、Atf5和Chop的表达(P<0.05)。可见,抑制Mic60会通过损害线粒体功能并触发ISR影响卵母细胞体外成熟效果。
