线粒体嵴重塑蛋白Mic60/Mitofilin在程序性坏死相关缺血再灌注损伤中的潜在作用

缺血再灌注损伤(IRI)是临床治疗缺血性疾病亟须攻克的难题。近年来,程序性坏死被认为是IRI导致细胞死亡的重要形式,其通过膜受体和细胞内信号转导分子的调控在IRI中发挥重要作用。而线粒体嵴重塑与IRI联系密切,其调控与线粒体融合分裂、氧化应激等有关。Mic60/Mitofilin作为一种线粒体内膜蛋白,可通过嵴重塑调控线粒体结构和功能,进而影响细胞命运转归,其可能通过影响细胞死亡在程序性坏死相关IRI中发挥作用。未来,阐明程序性坏死相关IRI中维持线粒体蛋白稳态的作用及机制可为缺血性疾病的治疗提供新思路。

抑制Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟过程中引起线粒体功能障碍和整合应激反应

本实验旨在探究Mic60在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用。选取4~6周龄的雌性C57BL/6J小鼠,注射孕马血清促性腺激素(PMSG)48 h后采集卵母细胞并随机分为对照组和Mic60抑制组(包括50、100、130、150μmol/L组,Miclxin组为130μmol/L)。卵母细胞体外培养16 h后,通过免疫荧光染色检测纺锤体形态、ROS水平、线粒体分布和质量,利用qPCR检测抗氧化基因表达、线粒体呼吸链亚基的表达、整合应激反应相关基因的表达。结果表明:与对照组相比,130μmol/L Mic60抑制剂会降低卵母细胞体外成熟率(78.29%vs.21.08%,P<0.01),并显著阻碍纺锤体的组装;与对照组相比,Miclxin组卵母细胞中的ROS水平升高(P<0.05),且Sod1(0.83 vs. 0.22)和Sod2(0.84 vs. 0.27)基因表达降低(P<0.05),线粒体分布异常比例升高(0.16 vs. 0.57,P<0.05),线粒体膜电位水平降低(1.61 vs. 1.05,P<0.05),ATP产生降低(1.16 vs. 0.79,P<0.05);Miclxin组卵母细胞线粒体呼吸链复合体亚基Ndufv2和Sdha表达降低(P<0.05),Cyc1表达升高(P<0.05),卵母细胞mtDNA拷贝数降低(19 324 vs. 9 066,P<0.05);与对照组相比,Miclxin组卵母细胞Oma1、Dele1、Eif2ak1、eIF2α基因表达上调(P<0.05),触发了整合应激反应(Integrated Stress Response,ISR)并上调了ISR主要效应因子Atf4、Atf5和Chop的表达(P<0.05)。可见,抑制Mic60会通过损害线粒体功能并触发ISR影响卵母细胞体外成熟效果。

蓝莓促进人肝细胞mitofilin/Mic60表达抑制超氧化物生成减轻代谢功能障碍相关肝病的肝损伤

目的研究蓝莓调控代谢功能障碍相关肝病(MAFLD)体外模型中线粒体内膜蛋白mitofilin/Mic60的作用及其机制.方法游离脂肪酸(FFA)诱导L02人肝细胞建立MAFLD细胞模型,设立正常组、模型组、80μg/mL蓝莓原浆处理组、Mic60短发夹RNA(Mic60 shRNA)转染组、Mic60敲低联合80μg/mL蓝莓原浆处理组.油红O染色观察细胞内的脂质沉积情况;噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度蓝莓原浆对FFA处理的L02细胞存活率的影响;可见分光光度法检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和脂代谢指标甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量.荧光显微镜观察肝细胞内活性氧(ROS)的情况;采用实时定量PCR及Western blot法分别检测Mic60的mRNA及蛋白表达.结果FFA诱导刺激L02细胞24 h后,L02细胞胞质内有大量红色脂滴沉积;80μg/mL蓝莓原浆处理的细胞存活率较高;蓝莓原浆处理组的ALT、AST、TG、TC、MDA检测结果和ROS的荧光强度显示均低于模型组,而SOD、GSH水平及Mic60 mRNA和蛋白水平均高于模型组.结论蓝莓促进Mic60表达,增加肝细胞SOD及GSH水平,减少ROS的生成,进而减轻MAFLD肝细胞损伤,调节脂质代谢紊乱.

小续命汤对急性脑缺血再灌注线粒体相关蛋白Hsp60、Mitofilin表达的影响

目的:观察小续命汤对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及对线粒体相关蛋白表达的影响。方法:60只雄性SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、小续命汤组、环孢素A组、溶媒组5组,每组12只。采用大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型,观察各组大鼠的一般情况、神经功能缺损,采用Nissl染色观察神经细胞损伤,Western blot和免疫组织化学法检测脑缺血再灌注后缺血半暗带皮层线粒体热休克蛋白60 (Heat shock protein 60,Hsp60)和mitofilin蛋白的表达。结果:与假手术组比较,模型组出现明显神经功能缺损,细胞发生缺血再灌注损伤,缺血半暗带皮层Hsp60、mitofilin蛋白的表达上调(P <0.05)。与模型组比较,小续命汤组、环孢素A组可显著改善大鼠神经功能缺损评分,减轻神经细胞的缺血再灌注损伤,并显著上调脑缺血半暗带皮层Hsp60、mitofilin蛋白的表达,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论:小续命汤可改善大鼠神经功能缺损评分,减轻神经细胞的缺血再灌注损伤,上调脑缺血半暗带皮层Hsp60、Mitofilin蛋白的表达,从而发挥脑保护的作用。

小鼠肝再生时线粒体蛋白Mic60/OPA1与能量供应的关系

目的探讨线粒体内膜蛋白Mic60和OPA1和小鼠肝切除术(partial hepatectomy,PH)后肝再生能量供应的关系。方法SPF雄性C57/6J小鼠随机分为假手术组(Sham)、85%PH和90%PH组。85%PH组将小鼠肝脏只保留右上叶;90%PH组只保留尾叶;Sham组开腹暴露肝脏25 min后直接关腹。统计术后7 d生存率。术后24 h取各组小鼠残余肝组织,检测其ATP含量、PCNA阳性率、Mic60和OPA1的表达水平。结果85%PH组7 d生存率达70%,明显高于90%PH组(P<0.001);术后24 h 85%PH组小鼠肝组织PCNA阳性率和ATP含量均明显高于Sham组(P<0.05),Mic60和OPA1表达水平均低于Sham组,两组Mic60比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论Mic60表达水平与小鼠肝大部切除术后24 h肝再生的能量供应呈负相关,或可考虑作为靶点提高急性肝衰组的残余肝能量供应水平。

艾灸对APP/PS1小鼠海马及前额叶皮质线粒体嵴结构蛋白MIC10、MIC60的影响

目的:观察艾灸对APP/PS1双转基因小鼠海马及前额叶皮质线粒体嵴结构蛋白MIC10、MIC60的改善作用,探讨艾灸保护线粒体嵴结构,改善阿尔茨海默病(AD)等神经退行性病变小鼠脑区线粒体能量代谢的相关机制。方法:将6月龄APP/PS1小鼠随机分为模型组、艾灸组,同月龄野生型C57BL/6J小鼠设为正常对照组。艾灸组施以百会、涌泉艾灸治疗。治疗结束后,采用Morris水迷宫定位航行实验测试各组小鼠空间学习记忆能力的变化,评价艾灸的治疗效应;采用免疫荧光染色法,采用CD46抗体标记MIC10,Mitofilin抗体标记MIC60,观察海马各区(DG、CA1、CA3)及前额叶皮层线粒体嵴结构蛋白MIC10、MIC60表达的变化。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠隐藏平台平均逃避潜伏期延长(P<0.01);与模型组比较,艾灸组小鼠平均逃避潜伏期显著缩短(P<0.01)。模型组小鼠海马(DG、CA1、CA3)及前额叶皮质层MIC10、MIC60表达量较正常对照组均显著减少(P<0.01,P<0.05)(前额叶皮质层MIC60除外),艾灸后,各区MIC10、MIC60蛋白表达量均增多(P<0.01,P<0.05)(海马CA1、CA3区MIC60除外)。结论:艾灸对AD学习记忆能力的改善可能与其增加海马及前额叶皮质区线粒体嵴结构蛋白、保护线粒体结构和功能、改善能量代谢有关。

一种5V线性直流稳压电源及漏电保护系统设计

本系统基于低压差线性稳压器MIC5158，以STC12C5A60S2单片机芯片为控制核心，可实现额定电压5V和额定电流1A的输出，具有线性输出、精度高和稳定性好等优点，可实现稳压电源输出功率的实时测量和显示，并具有漏电保护功能。

线粒体内膜蛋白表达对肝癌细胞生物学作用研究

目的线粒体的功能取决于线粒体的膜系统,而线粒体内膜的形态由近期发现的线粒体接触位点复合物(mitochondrial contact site and crista organizing system,MICOS)所调节,MICOS复合物的突变可改变嵴的形成,导致线粒体功能障碍。本研究采用慢病毒shRNA靶向敲低MICOS复合物亚基蛋白-线粒体内膜蛋白Mic19及Mic60表达,并研究敲低Mic19和Mic60对肝癌细胞生物学作用的影响。方法根据NCBI中的序列设计、构建并包装敲低Mic19及Mic60的重组慢病毒,收集被病毒上清感染后经嘌呤霉素筛选得到的肝癌HepG2阳性细胞,并以空白组、空载pLKO.1慢病毒质粒组作为对照。采用蛋白印迹法检测Mic19及Mic60蛋白的表达,以筛选敲低效率最高的稳定细胞株。采用MTT法、划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭情况,观察敲低Mic19及Mic60蛋白表达对肝癌细胞生物学行为的影响。结果 Mic19敲低组中蛋白相对表达量shRNA Mic19-1(0.579±0.042)和shRNA Mic19-2(0.524±0.111)均低于空白组(1.065±0.105)或空载组(1.07±0.092),差异有统计学意义,均P<0.01。Mic60敲低组蛋白相对表达量shRNA Mic60-1(0.172±0.107)、shRNA Mic60-2(0.269±0.027)明显低于空白组(1.065±0.105)或空载组(1.07±0.092),差异有统计学意义,均P<0.01。生长曲线表明,Mic19敲低组至感染第36h时的吸光度(A)值低于对照组,均P<0.05;Mic60敲低组至感染第12h时的A值显著低于对照组,P<0.01。划痕实验表明,至第48hMic19敲低组细胞迁移距离为(286.8±38.97)μm,Mic60敲低组细胞迁移距离为(214.6±41.64)μm,与空白组(500.8±25.6)μm或空载组(487.3±31.37)μm相比差异均有统计学意义,均P<0.01。在不铺胶的Transwell迁移实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(440.4±65.35)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(235.2±21.3)个/低倍视野,均少于空白组(574.8±36.4)或空载组(574±53.95)个/低倍视野,均P<0.01。在铺胶的侵袭实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(172.4±15.5)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(118.2±25.53)个/低倍视野,均少于对照组空白组(238.6±22.85)或空载组(227.8±22.27)个/低倍视野,差异有统计学意义,均P<0.01。结论重组慢病毒shRNA Mic19-2、shRNA Mic60-1可分别有效敲低HepG2细胞Mic19、Mic60的表达。慢病毒shRNA靶向敲低Mic19及Mic60表达可抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并为后续进一步研究线粒体内膜蛋白(Mic19、Mic60)对肝癌细胞发生发展的影响提供依据。