MicroRNA-194缓解高脂环境下肝细胞脂质沉积、炎症反应的分子机制研究

目的研究microRNA-194(miR-194)缓解高脂环境下肝细胞脂质代谢及炎症反应的分子机制。方法以低脂饲料(low-fat diet,LFD)及高脂饲料(high-fat diet,HFD)喂养构建对照组及脂肪肝小鼠模型,HE染色、油红染色观察建模情况。qPCR检测二组小鼠肝组织中miR-194、促脂质合成因子SCD1、ACC、促炎因子TNF-α、IL-6表达水平。棕榈酸(palmitic acid,PA)刺激肝细胞株LO2,过表达miR-194后qPCR检测人肝细胞系LO2细胞内SCD1、ACC、TNF-α、IL-6表达水平,油红染色检测LO2细胞内脂质沉积情况,免疫荧光检测LO2细胞内TNF-α变化。结果脂肪肝小鼠模型构建成功。与LFD组小鼠相比,HFD组小鼠miR-194表达明显降低[LFD:1.000±0.147 vs HFD:0.634±0.116,(t=3.478,P=0.025)]。SCD1、ACC1表达明显升高[SCD1 LFD:1.000±0.287 vs HFD:1.658±0.216,(t=4.802,P=0.009);ACC LFD:1.000±0.252 vs HFD:1.851±0.245,(t=4.194,P=0.015)],TNF-α、IL-6表达明显升高[TNF-αLFD:1.000±0.172 vs HFD:1.952±0.147,(t=7.288,P=0.002);IL-6 LFD:1.000±0.207 vs HFD:1.452±0.108,(t=3.242,P=0.029)]。在高脂环境下,过表达miR-194后,qPCR结果显示LO2细胞内SCD1、ACC表达明显下降[SCD1 miR-NC:1.000±0.149 vs miR-194:0.625±0.112,(t=3.340,P=0.029);ACC miR-NC:1.000±0.204 vs miR-194:0.572±0.124,(t=3.105,P=0.038)],TNF-α、IL-6表达明显减少[TNF-αmiR-NC:1.000±0.149 vs miR-194:0.563±0.059,(t=4.723,P=0.009);IL-6 miR-NC:1.000±0.156 vs miR-194:0.685±0.112,(t=2.853,P=0.048)]。油红染色显示LO2细胞内脂质沉积明显减少,免疫荧光结果显示细胞内TNF-α表达明显下[miR-NC:1.000±0.124 vs miR-194:0.655±0.152,(t=3.020,P=0.039)],炎症反应明显减轻。结论miR-194可以延缓肝细胞内脂质沉积,减轻高脂处理诱导的炎症反应,延缓脂肪肝的进展,这可能成为治疗非酒精性脂肪性肝病的新靶点。

血清微小RNA-194与氨基酸转移酶联合检测在小儿支气管肺炎中的临床价值

目的探讨血清微小RNA-194(miR-194)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)在支气管肺炎患儿中的表达及早期识别价值。方法选取2020年3月至2023年2月在沧州市人民医院收治的240例支气管肺炎患儿作为研究对象,根据病情严重程度,将其分为轻症组(n=167)和重症组(n=73);另选取同期入院体检的240例健康儿童作为对照组。采用RT-qPCR、免疫荧光定量等方法检测3组血清miR-194、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、AST、ALT、乳酸脱氢酶(LDH)水平;Pearson法分析miR-194、ALT和AST与白细胞计数(WBC)、中性粒细胞(Neu)、CRP、PCT、LDH及临床肺部感染评分(CPIS)的相关性,受试者工作特征(ROC)曲线分析三者对重症支气管肺炎的诊断价值。结果与对照组比较,轻症组和重症组患儿血清miR-194、ALT和AST水平均明显升高(P<0.05),且重症组高于轻症组(P<0.05);支气管肺炎患儿血清miR-194、ALT、AST与WBC、Neu、CRP、PCT、LDH及CPIS呈正相关(P<0.05);血清miR-194、ALT、AST三者联合诊断重症支气管肺炎曲线下面积为0.920(95%CI:0.878~0.962),敏感度为83.56%,特异度为89.82%。结论支气管肺炎患儿血清miR-194、ALT、AST水平升高,与病情严重程度有关,三者联合检测对患儿病情有一定评估价值。

糖尿病肾病患者血清microRNA-21含量及其与氧化应激指标的相关性

目的分析糖尿病肾病(DN)患者血清micro RNA-21(mi R-21)含量及其与氧化应激指标的相关性。方法选择在该院接受治疗的DN患者82例作为观察组,根据病情严重程度分为轻度DN组(47例)、中重度DN组(35例),另取同期体检健康人60例作为对照组。检测各组患者的血清mi R-21含量,超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、晚期蛋白氧化产物(AOPP)等氧化应激指标水平,进一步分析两者之间的相关性。结果 1早期DN组、中晚期DN组患者血清mi R-21含量低于对照组,中晚期DN组患者血清mi R-21含量低于早期DN组;2早期DN组、中晚期DN组患者血清SOD、MDA、AOPP水平高于对照组,中晚期DN组患者血清SOD、MDA、AOPP水平高于早期DN组;3血清mi R-21含量与SOD、MDA、AOPP等氧化应激指标水平呈负相关。结论 DN患者的血清mi R-21含量降低,且与患者的氧化应激指标水平相关,有望成为诊断及指导疾病治疗的有效指标之一。

红景天苷通过micro RNA-370改善2型糖尿病小鼠糖代谢的作用机制

目的观察红景天苷改善2型糖尿病小鼠血糖作用,探讨红景天苷改善2型糖尿病小鼠糖代谢紊乱的分子机制。方法采用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病小鼠模型,检测血糖相关指标、血清和肝脏micro RNA-370表达,以及肝组织糖异生关键酶(PEPCK/G6Pase)蛋白表达水平,观察红景天苷对2型糖尿病小鼠糖代谢紊乱的改善作用。分离培养小鼠原代肝细胞,采用瞬时转染技术将micro RNA-370沉默或过表达,观察micro RNA-370对糖代谢的影响及红景天苷调节糖代谢的分子机制。结果与模型对照组比较,红景天苷各剂量组小鼠血糖相关指标均明显改善(P<0.05);血清和肝组织micro RNA-370表达水平以及肝组织PEPCK/G6Pase蛋白相对表达水平均不同程度降低,且呈剂量依赖性,中、大剂量组降低较明显(P<0.05),小剂量组有降低趋势,但差异无统计学意义。细胞实验中,与空白对照组比较,红景天苷组和micro RNA抑制剂组PEPCK/G6Pase表达均被抑制(P<0.05),micro RNA-370激动剂组PEPCK/G6Pase表达明显促进(P<0.05),红景天苷与micro RNA-370激动剂联用能逆转micro RNA-370激动剂所致PEPCK/G6Pase蛋白表达增高(P<0.05)。结论红景天苷能明显改善2型糖尿病小鼠糖代谢紊乱,且该作用至少部分通过抑制micro RNA-370实现。

MicroRNA-126和血管内皮生长因子在胚胎停育绒毛组织中的表达及相关性研究

目的通过分析孕早期胚胎停育与正常胚胎绒毛组织中microRNA-126(miR-126)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达差异,探讨其在早期胚胎停育中的相关性。方法收集孕早期胚胎停育和正常胚胎绒毛组织各28例作为胚胎停育组和对照组,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组miR-126和VEGF mRNA表达水平的变化。结果 1两组绒毛组织中均有miR-126表达,胚胎停育组绒毛组织中miR-126的表达高于对照组,但差异无统计学意义。2胚胎停育组绒毛组织中VEGF的表达低于对照组,差异有统计学意义。3胚胎停育组绒毛组织中miR-126与VEGF的表达呈负相关;对照组绒毛组织中miR-126与VEGF的表达呈正相关。结论 1胚胎停育绒毛组织中VEGF的表达低于正常胚胎。2VEGF的表达变化与胚胎停育的发生有一定的相关性。

microRNA-133a拮抗苯肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大

目的利用心肌细胞肥大体外模型研究mi R-133a抗心肌肥大的作用机制。方法构建mi R-133a腺病毒表达载体,导入293细胞并收获高表达mi R-133a的病毒;取12只出生1~3 d内的小鼠心脏,采用酶消化及梯度离心法获得心肌细胞,分为对照组和模型组,模型组加入苯肾上腺素（PE）诱导;将高表达mi R-133a的腺病毒感染模型组的心肌细胞,观察细胞面积的变化,RTPCR检测Acta1、Actc1、Actb、Myh6、Myh7、BNP基因的表达。结果模型组心肌细胞加入PE培养后,较对照组面积增大3倍以上,Acta1等基因表达显著增高;肥大后模型组的心肌细胞采用mi R-133a病毒感染后较未加入mi R-133a病毒的模型组的心肌细胞的面积缩小,Acta1等基因表达显著降低。结论 mi R-133a是心肌肥大的重要调节因子,有拮抗心肌肥大的作用。

microRNA-155在类风湿关节炎外周血中的表达及临床意义

目的通过研究micro RNA-155(mi R-155)在类风湿关节炎(RA)患者外周血的表达水平,分析mi R-155与疾病临床特征的相关性,探讨其在RA发病及疾病进展中的意义。方法抽取50例初发RA患者及36例健康对照组外周血分离PBMC(外周血单个核细胞),提取和纯化mi RNA,实时定量PCR检测mi R-155的表达,以小分子RNA U6作为内对照,对mi R-155的表达量进行相对定量分析。同时收集RA患者有关的临床参数,统计分析mi R-155的表达水平与RA合并临床参数的相关性。对RA活动组中,随机分为甲氨蝶呤(MTX)单药治疗组,肿瘤坏死因子(TNF)-α抑制剂单药治疗组,两组随访观察12周,收集患者治疗前后外周血。实时荧光定量PCR法检测RA患者治疗前后外周血mi R-155的表达水平变化。结果RA患者中PBMC中mi R-155的表达水平较健康对照组明显升高,(P<0.01);同时RA患者mi R-155的表达与患者活动度有关,与肺间质病变等无明显相关,RA患者TNF-α抑制剂单药治疗组中,mi R-155的表达较治疗前下降,而在甲氨蝶呤治疗组中无明显下降。结论 mi R-155在RA的PBMC中异常高表达,且与RA的活动度相关,提示mi R-155可能可作为RA诊断及RA活动的一个预测指标。mi R-155在RA的发病机制中可能参与了TNF-α的致炎过程。

血清microRNA-375在非小细胞肺癌中的表达水平及其临床意义

目的：探讨micro RNA-375（mi R-375）在非小细胞肺癌（non small-cell lung cancer,NSCLC）患者血清中的表达水平及临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR方法检测82例非小细胞肺癌患者和对照组100例健康人血清的mi R-375的表达水平,分析其与临床病理参数之间的关系。结果：NSCLC组血清mi R-375表达水平显著低于对照组,并且其表达与临床分期和淋巴结转移有关（P〈0.05）。血清mi R-375在ROC曲线下面积（area under the ROC curve,AUC）为0.905（95%CI：0.860~0.950）。当血清mi R-375临界值取0.995时,对NSCLC诊断的灵敏度为92.0%,特异度为78.0%。结论：血清mi R-375可能作为一种新型NSCLC诊断的分子标志物和潜在的基因靶向治疗靶点。

microRNA-21通过促进成纤维细胞的增殖和分化调节心肌梗死后的心脏重塑

目的探讨小鼠心肌梗死模型中microRNA-21(miR-21)对心脏成纤维细胞增殖和分化的影响。方法利用左前降支结扎法构建小鼠心肌梗死模型(心肌梗死组),以心电图及病理改变作为建模成功的观察指标。采用荧光定量PCR检测各组心肌组织miR-21的表达。利用miR-21的模拟物(miR-21 mimic)转染小鼠成纤维细胞(miR-21 mimic组),使其在细胞中呈过表达状态,然后标记5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU),通过荧光显微镜观察成纤维细胞的增殖情况,蛋白质印迹法检测成纤维细胞α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和小鼠Smad同源物7(Smad7)的表达,并与随机对照组及空白对照组比较。结果与假手术组比较,心肌梗死组梗死交界区的miR-21的表达量明显上调[(6.043±0.231)×10-4vs(1.620±0.451)×10-4,P<0.01],miR-21 mimic组成纤维细胞miR-21基因表达较随机对照组和空白对照组显著上调[(4.839±0.705)×10-4vs(1.143±0.064)×10-4vs(1.017±0.201)×10-4,P<0.01],miR-21mimic组成纤维细胞EdU染色阳性率较随机对照组和空白对照组显著增加[(27.892±1.645)%vs(12.553±1.227)%vs(13.946±1.550)%,P<0.01];同时,miR-21 mimic组成纤维细胞Smad7蛋白的表达明显下调,而α-SMA的表达显著上调。结论心肌梗死后,上调的miR-21可以通过调节转化生长因子(TGF)-β信号通路中Smad7的表达促进成纤维细胞的增殖和分化,进而调节心梗后的心脏重塑。

MicroRNA-146a与风湿性疾病

MicroRNAs（miRNAs）是一类短小（20～24nt）的非编码RNA,通过对基因表达的转录后调节参与很多生物学过程。越来越多的研究证明,miRNAs尤其miRNA-146a在免疫和自身免疫中发挥着重要作用。本文将miRNA-146a在风湿性疾病中的生物学功能及研究进展作一综述。

抑制microRNA-21表达降低HCT-116细胞侵袭转移能力的实验研究

目的:探讨抑制人结肠癌细胞HCT-116 micro RNA-21表达降低结肠癌细胞侵袭转移能力作用机制。方法:应用表达反义micro RNA-21的质粒mi RZip21转染HCT-116细胞,检测micro RNA-21的变化,Target Scan和Pic Tar等工具筛选与侵袭转移相关的靶基因,实时定量PCR方法检测转染前后靶基因m RNA的变化,Western blot检测靶基因蛋白表达变化,平皿划痕和Transwell实验观察抑制micro RNA-21与否HCT-116细胞转移和侵袭能力。结果:筛选出4种与侵袭转移相关的micro RNA-21靶基因:TIMP-3,RECK,BMPRⅡ和PCDH17;mi RZip21质粒转染HCT-116后,micro-RNA 21表达水平下降约40%,靶基因TIMP-3和RECK的m RNA及靶蛋白表达上升明显,有统计学意义(P<0.05);平皿划痕和Transwell实验结果表明抑制micro RNA-21后,HCT-116细胞转移侵袭能力明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:抑制micro RNA-21的表达能够减弱HCT-116细胞的侵袭和转移能力。

血小板反应蛋白-1 mRNA和微小RNA-194与2型糖尿病肾病的关系

目的探讨血小板反应蛋白(TSP)-1 mRNA与微小RNA(miR)-194与2型糖尿病肾病的关系。方法纳入2型糖尿病(T2DM)患者167例为T2DM组,随机选择健康体检者163例为健康对照组。再根据尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)将167例T2DM患者分为正常白蛋白尿组(UACR<30 mg/g,56例)、微量白蛋白尿组(30 mg/g≤UACR<300 mg/g,55例)及大量白蛋白尿组(UACR≥300 mg/g,56例)。收集所有受试者的一般资料、实验室检查结果、miR-194及TSP-1 mRNA水平并分组进行比较。采用Pearson或Spearman相关分析探讨影响miR-194及TSP-1 mRNA表达水平的相关因素,采用多元线性逐步回归分析探讨影响miR-194及TSP-1 mRNA表达水平的独立因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线探讨TSP-1 mRNA和miR-194对2型糖尿病肾病的诊断价值。结果T2DM组患者收缩压、舒张压、空腹血浆葡萄糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血尿酸(SUA)、miR-194及TSP-1 mRNA水平均高于健康对照组,BMI、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平均低于健康对照组(P<0.05)。TSP-1 mRNA及miR-194表达水平在正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组及大量白蛋白尿组患者中比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson或Spearman相关分析结果显示,T2DM患者TSP-1 mRNA与胱抑素C(Cys-C)、UACR呈正相关,miR-194与UACR呈正相关(P<0.05)。多元线性逐步回归分析结果显示,Cys-C、UACR是T2DM患者TSP-1 mRNA的独立影响因素,UACR是miR-194的独立影响因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,TSP-1 mRNA及miR-194诊断2型糖尿病肾病的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.756(95%CI 0.620~0.893,P<0.01)和0.584(95%CI 0.421~0.748,P<0.01)。结论血清TSP-1 mRNA及miR-194在T2DM患者中表达明显升高,在不同程度尿微量白蛋白患者中的表达存在差异,是早期2型糖尿病肾病的危险因素,对其具有一定的诊断评估价值。

糖尿病视网膜病变病人血清微小RNA-29c、微小RNA-194的表达

目的检测微小RNA-29c(miR-29c)和微小RNA-194(miR-194)在糖尿病视网膜病变(DR)病人血清中的表达特点及其临床意义。方法通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测在汉中市人民医院就诊的98例DR病人、98名Ⅱ型糖尿病(T2DM)病人和98例同期体检健康者(NC)血清中miR-29c和miR-194的表达水平,多因素logistic回归分析影响DR发生的危险因素。Pearson相关分析DR病人血清miR-29c和miR-194与各生化指标的相关性。结果DR组、DM组和NC组总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、踝臂指数(ABI)、脉搏波传导速度(PWV)水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);DR组和DM组血清中糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FPG)水平及miR-29c表达水平分别为(9.40±1.61)%比(8.53±1.78)%、(9.41±1.76)比(8.42±1.67)mmol/L、(1.29±0.57)比(1.12±0.25)明显高于NC组:(7.93±2.64)%、(6.41±1.62)mmol/L、(1.01±0.10),DR组明显高于DM组,而DR组和DM组miR-194表达水平明显低于NC组,DR组明显低于DM组(P<0.05);DR病人血清中miR-29c相对表达量与HbA1c、FPG水平均呈正相关(P<0.05),与血清miR-194相对表达量负相关(P<0.05);DR病人miR-194与miR-29c相对表达量呈负相关(P<0.05);多因素logistic回归分析发现,FPG水平高、HbA1c水平高、miR-29c水平高是DR发生的独立危险因素(均P<0.05),miR-194水平高是DR发生的保护因素(P<0.05)。结论DR病人血清中miR-29c表达相对DM病人和健康者上调,miR-194表达下调,miR-29c和miR-194与DR的发生发展有关。

胃癌组织中microRNA-224阳性表达与患者预后相关性分析

目的:探讨micro RNA-224于胃癌组织中的阳性表达与患者临床病理特征及预后的相关性。方法:应用原位杂交技术检测micro RNA-224在50例石蜡固定癌旁非肿瘤胃黏膜组织及112例石蜡胃肿瘤组织切片中的表达情况,分析其与肿瘤患者各病理参数及预后的相关性。原位杂交按照原位杂交试剂盒的说明书进行。结果:micro RNA-224在胃癌组织中阳性表达率49.1%(55/112),癌旁非肿瘤胃黏膜组织中阴性表达。其阳性表达与TNM分期、淋巴结转移、远处转移及浸润深度存在相关性(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的部位、分化程度、Lauren分型无关(P>0.05)。micro RNA-224阴性表达比阳性表达者5年生存率高,差异有统计学意义(P<0.001)。经COX多因素分析显示:micro RNA-224的表达是影响胃癌患者预后的独立因素之一(P<0.05)。结论:micro RNA-224在肿瘤组织中阳性表达与TNM分期、淋巴结转移、远处转移及浸润深度密切相关,是影响胃癌患者预后的独立因素之一。

MicroRNA-599对静脉曲张中血管平滑肌细胞去分化的影响及其机制研究

目的研究micro RNA-599(miR-599)在曲张静脉中的表达,探讨miR-599是否通过下调血小板源性生长因子B(PDGF-BB),抑制曲张静脉中血管平滑肌细胞(VSMCs)去分化。方法收集大隐静脉移植术患者中曲张静脉和正常静脉标本,通过实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测42例曲张静脉组织及39例正常静脉组织中miR-599、miR-200、miR-145、miR-146b、miR-155的表达;Western blot检测两组标本中SMactin、SM-22、SM-MCH、OPN的表达;在细胞实验中,转染miR-599mimic和miR-NC至离体培养的VSMCs中,Western blot检测VSMCs中SM-actin、SM-22、SM-MCH、OPN、PDGF-BB的表达,噻唑蓝法测细胞增殖、划痕实验观察细胞迁移,利用荧光素酶试验验证PDGF是miR-599的靶基因。结果相比于正常静脉组织,miR-599在曲张静脉中的表达降低(F=73.012,P=0.001)。两组miR-146b、miR-200、miR-30、miR-155的表达量比较,差异无统计学意义。相比于正常静脉组织,曲张静脉组织中SM-actin、SM-22、SM-MCH的表达降低(P<0.05),OPN的表达升高(F=56.414,P=0.009);在细胞实验中,相比于对照组,miR-599组VSMCs中SM-actin、SM-22、SM-MCH的表达升高(P<0.05),OPN的表达降低(F=27.353,P=0.022),细胞增殖减少(F=37.824,P=0.016),迁移减少(F=69.365,P=0.001),PDGF表达量减少(F=55.345,P=0.004)。荧光素酶试验结果显示,miR-599能够降低PDGF-3'-UTR质粒的荧光素活性(F=21.429,P=0.036)。结论在曲张静脉组织中,miR-599低表达。在VSMCs中,miR-599可以通过下调PDGF-BB而抑制VSMCs去分化。

微RNA-194在宫颈癌中的表达及临床意义

目的探讨微RNA(miRNA)-194在宫颈癌组织中的表达情况及其临床意义。方法回顾性选取2013年5月至2016年1月于邯郸市第一医院行手术治疗的136例宫颈癌病人为研究对象,采用分层抽样选取58例宫颈癌病人的癌组织及相应癌旁正常组织,其余78例病人仅选取癌组织,获取136例宫颈癌组织标本及58例癌旁正常组织标本。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测宫颈癌组织和癌旁组织中miRNA-194表达水平,分析miRNA-194表达与宫颈癌病人临床病理特征及预后的关系。结果qRT-PCR结果表明136例宫颈癌病人癌组织miRNA-194的表达量(1.140±0.655)明显低于癌旁组织(4.502±1.168)(P<0.001)。miRNA-194表达水平与宫颈癌病人的国际妇产科联盟(FIGO)分期(P=0.001)和肿瘤长径(P=0.033)相关。miRNA-194低表达的宫颈癌病人的生存期显著低于miRNA-194高表达病人[HR 95%CI=2.17(1.21,3.90),log-rank P=0.012]。Cox回归分析结果表明miRNA-194表达是影响宫颈癌病人预后的独立因素。结论miRNA-194在宫颈癌的发生发展中有一定作用,其在宫颈癌病人癌组织中更低,miRNA-194有可能成为宫颈癌诊断和预后的指标。

稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株构建的试验研究

目的研究构建可以稳定表达HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株的方法。方法采用LE培养基培养大鼠卵圆细胞株(LE/6),以质粒Pc DNA3.1-HBVx中的HBVx序列为模板,PCR法扩增得到目的基因片段A。将HBx目的基因片段和质粒载体p EGFP-Nl进行双酶切,线性化得到重组质粒命名为p EGFP-HBx。重组质粒转化感受态大肠埃希菌DH5a,并进行筛选培养。用脂质体法将质粒转染卵圆细胞,作为p EGFP-HBx组;用脂质体法将质粒转染质粒载体p EGFP-Nl,作为p EGFP-NI质粒组。最后将Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养,培养24 h后用荧光显微镜观察转染细胞的荧光表达情况。结果 p EGFP-HBx中GFP表达量经荧光定量PCR仪器确定为92.28%,且表达程度强;Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养完成后,p EGFP-HBx组内MicroRNA-21的转录水平经仪器测量为1.77±0.24,显著高于p EGFP-NI质粒组内的0.36±0.21,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功地构建了稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株,为进一步研究HBx蛋白、mi RNA-21、肝卵圆细胞与肝癌之间的关系提供了实验基础。

microRNA-21、microRNAlet-7a在三阴性乳腺癌与LuminalA型乳腺癌血清中的表达差异

目的:探讨micro RNA-21、micro RNAlet-7a在三阴性乳腺癌与Luminal A型乳腺癌中的差异及与临床参数间相关性,为三阴性乳腺癌的治疗提供分子靶点。方法:收集三阴性、Luminal A型乳腺癌各33例以及健康者血清29例,通过q PCR检测血清中micro RNA-21、let-7a的表达情况。结果:micro RNA-21在三阴组血清中表达高于Luminal A组(P<0.05)及正常组(P<0.05)。Let-7a在三阴组血清中表达低于正常组(P<0.05)。三阴组血清中micro RNA-21高表达与临床分期晚呈正相关(P>0.05)。结论:micro RNA-21在Luminal A型与三阴性乳腺癌中的表达差异可作为三阴性乳腺癌特异性治疗的候选靶点。

胃癌中microRNA-218调控BMI1基因表达的作用及机制

目的探讨胃癌中microRNA-218(mi R-218)调控BMI1基因表达的作用及机制。方法应用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测胃癌及癌旁组织中miR-218及BMI1基因的表达。将miR-218的前体(mi R-218 precursor)转染胃癌BGC823细胞,Western blot检测BMI1蛋白的表达。应用荧光素酶实验分析miR-218是否与BMI1基因3’非翻译区(3’-UTR)结合。结果 RT-PCR结果显示,相对癌旁组织,胃癌组织中miR-218的表达下调显著,而BMI1在胃癌组织中的表达则呈现明显的上调,miR-218与BMI1在胃癌及癌旁组织中的表达均为明显的负相关。在转染miR-218 precursor的胃癌BGC823细胞中,BMI1的蛋白表达显著下调。荧光素酶实验结果证实miR-218能够特异性地结合BMI1基因的3’-UTR,并与其表达呈负相关。结论 miR-218与BMI1基因的表达异常与胃癌的发生相关,BMI1基因是miR-218的靶基因,miR-218在胃癌细胞中能够靶向沉默BMI1基因。

敲降长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录因子1调控微小RNA-194-5p/叉头框蛋白A1通路对脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞凋亡的影响

目的观察敲降长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录因子1(lncRNA-MALAT1)调控微小RNA-194-5p(miR-194-5p)/叉头框蛋白A1(FOXA1)通路对脂多糖(LPS)诱导的人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)凋亡的影响.方法采用1 mg/L LPS处理HPAEpiC复制脓毒症急性肺损伤(ALI)体外模型.采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测HPAEpiC细胞中MALAT1、miR-194-5p的表达水平,构建MALAT1敲降载体、miR-194-5p抑制剂及FOXA1抑制剂转染HPAEpiC,将细胞分为空白对照组、LPS模型组、LPS+生理盐水组、LPS+MALAT1抑制剂组、LPS+MALAT1抑制剂+生理盐水组、LPS+MALAT1抑制剂+miR-194-5p抑制剂组和LPS+FOXA1抑制剂组.采用CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒、流式细胞术、蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测MALAT1或其敲降后对LPS诱导的HPAEpiC增殖及凋亡和FOXA1表达的影响;采用双荧光素酶报告基因检测lncRNA-MALAT1、miR-194-5p及FOXA1的靶向调控关系.结果与空白对照组比较,LPS可上调HPAEpiC-MALAT1的表达,促进HPAEpiC凋亡并抑制其增殖〔MALAT1(2^(-ΔΔCt)):0.83±0.09比0.15±0.02,HPAEpiC凋亡率:(21.31±2.31)%比(5.41±0.42)%,24 h HPAEpiC增殖活性(A值):0.42±0.03比0.54±0.02,均P<0.05〕;与LPS+生理盐水组比较,敲降MALAT1可抑制LPS诱导的HPAEpiC凋亡并促进其增殖〔细胞凋亡率:(6.40±0.40)%比(21.38±2.31)%,24 h HPAEpiC增殖活性(A值):0.53±0.03比0.40±0.02,均P<0.05〕,降低MALAT1的表达(2-ΔΔCt:0.20±0.03比1.02±0.09,P<0.05).双荧光素酶报告基因及Western Blot证实,敲降MALAT1通过靶向上调miR-194-5p从而抑制FOXA1在LPS诱导的HPAEpiC中的表达〔miR-194-5p(2^(-ΔΔCt)):5.27±0.15比1.21±0.09,FOXA1蛋白表达(灰度值):0.36±0.05比1.00±0.07,均P<0.05〕,miR-194-5p抑制剂能逆转MALAT1敲降在LPS诱导的HPAEpiC中对FOXA1的作用〔FOXA1蛋白表达(灰度值):2.76±0.20比1.00±0.07,P<0.05〕,抑制FOXA1表达能减轻LPS诱导的HPAEpiC凋亡并促进其增殖〔FOXA1蛋白表达(灰度值):0.28±0.03比1.00±0.03,HPAEpiC凋亡率:(6.78±0.38)%比(19.21±0.70)%,24 h HPAEpiC增殖活性(A值):0.59±0.20比0.41±0.02,均P<0.05〕.结论敲降MALAT1通过靶向上调miR-194-5p抑制FOXA1的表达,进而抑制LPS诱导的HPAEpiC凋亡,为脓毒症ALI的诊断和治疗提供了潜在的分子靶点.