miR-325-3p靶向CLDN1调控人肝癌细胞增殖、侵袭与迁移

目的探讨微小核糖核酸-325-3p(miR-325-3p)靶向紧密连接蛋白1(CLDN1)调控人肝癌细胞增殖、侵袭与迁移的作用。方法将对数生长期的人肝癌细胞株SMMC-7721分为四组:阴性对照组、上调组、下调组和正常组。荧光显微镜观察各组细胞转染效率;细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测各组细胞增殖活性;侵袭小室(Transwell)实验检测各组细胞侵袭和迁移活性;实时-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞miR-325-3p、CLDN1、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)信使核糖核酸(mRNA)表达;免疫印迹法(WB)检测各组CLDN1、ERK1/2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表达及p-ERK1/2水平;双荧光素酶报告基因检测验证miR-325-3p对CLDN1的作用。结果阴性对照组、上调组和下调组细胞转染效率分别为(91.38±16.21)%、(92.17±15.93)%、(94.12±17.05)%;与正常组、阴性对照组和上调组比,下调组细胞吸光度值上升,增殖抑制率显著下降,侵袭细胞数和迁移细胞数增加,miR-325-3p表达和E-cadherin mRNA和蛋白表达显著下降,CLDN1、N-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA和蛋白表达上升,ERK1/2 mRNA表达上升,p-ERK1/2水平、p-ERK1/2/ERK1/2水平上升,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);双荧光素酶报告基因实验证实miR-325-3p可靶向调控CLDN1的表达。结论miR-325-3p可抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移,可能与靶向CLDN1,抑制ERK1/2表达,促进E-cadherin表达,抑制N-cadherin、Vimentin、MMP-2表达相关。

miR-325通过调控TFRC抑制胶质瘤细胞恶性生物学特征的实验研究

目的研究miR-325通过调控转铁蛋白受体(TFRC)基因在胶质瘤细胞中的表达对胶质瘤细胞进程的影响和分子机理。方法(1)收集天津医科大学总医院神经外科自2015年1月至2018年1月手术切除并经病理证实的脑胶质瘤标本35例,以患者癌旁正常组织作为对照。反转录-定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测肿瘤组织和癌旁组织miR-325、TFRC mRNA的表达,比较不同临床特征患者肿瘤组织miR-325的表达及miR-325低表达、高表达患者的生存曲线。(2)RT-qPCR检测体外培养的HA、U251和U87细胞miR-325的表达;荧光素酶活性实验检测U251和U87细胞miR-325与靶基因TFRC的调控关系;将U251、U87细胞分为miR-325模拟物组、无义序列组,分别转染miR-325模拟物和无义序列,48 h后分别应用RT-qPCR、Western blotting检测细胞TFRC mRNA和蛋白的表达;将U251、U87细胞分为对照小干扰RNA(siRNA)+无义抑制物组、TFRC干扰RNA(siTFRC)+无义抑制物组、siTFRC+miR-325抑制物组,分别转染对应物质后48 h应用Western blotting检测细胞TFRC蛋白的表达。CCK-8实验检测细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;将U251、U87细胞分为pcDNA3.1空载体+无义序列组、TFRC pcDNA3.1+无义序列组、TFRC pcDNA3.1+miR-325模拟物组,分别转染对应物质后48 h应用Western blotting检测细胞TFRC蛋白的表达,CCK-8实验检测细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果(1)与癌旁组织比较,患者肿瘤组织miR-325的表达下降,TFRC mRNA的表达上升,差异均有统计学意义(P<0.05);肿瘤组织TFRC mRNA、miR-325的表达呈负相关关系(r=-0.363,P=0.001)。与Karnofsky功能状态评分≥80分患者比较,<80分患者肿瘤组织miR-325的表达降低;与WHO分级Ⅰ~Ⅱ级胶质瘤比较,Ⅲ~Ⅳ级胶质瘤组织miR-325的表达降低;差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-325低表达患者的生存率低于miR-325高表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与HA细胞比较,U87、U251细胞miR-325的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);在TFRC野生型(WT)表达载体转染的细胞中,miR-325模拟物组细胞荧光素酶活性低于无义序列组,而miR-325抑制物组细胞荧光素酶活性高于无义抑制物组,差异有统计学意义(P<0.05);与无义序列组比较,miR-325模拟物组U87和U251细胞TFRC mRNA和蛋白的表达均下降,差异有统计学意义(P< 0.05)。与对照siRNA+无义抑制物组比较,siTFRC+无义抑制物组细胞TFRC蛋白的表达、吸光度值、侵袭细胞数降低;与siTFRC+无义抑制物组比较,siTFRC+miR-325抑制物组细胞TFRC蛋白的表达、吸光度值、侵袭细胞数增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与pcDNA3.1空载体+无义序列组比较,TFRC pcDNA3.1+无义序列组细胞TFRC蛋白的表达、吸光度值、侵袭细胞数升高;与TFRC pcDNA3.1+无义序列组比较,TFRC pcDNA3.1+miR-325模拟物组细胞中TFRC蛋白的表达、吸光度值、侵袭细胞数降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-325在胶质瘤细胞中表达下调并且具有抑癌作用,miR-325低表达患者预后较差。miR-325通过抑制靶基因TFRC的表达抑制癌细胞进展。