MicroRNA-150基因敲除小鼠鉴定

1目的通过基因组特异PCR扩增鉴定MicroRNA-150基因敲除小鼠。2方法利用碱裂解法提取鼠尾基因组DNA,在小鼠MicroRNA-150基因两端设计特异引物,PCR扩增检测。3结果正常对照小鼠DNA经PCR扩增产生长度为866个碱基对的DNA片段,MicroRNA-150基因敲除小鼠产生长度为262个碱基对的DNA片段。4结论通过碱裂解法提取鼠尾DNA并采用特异引物扩增能够准确鉴定MicroRNA-150基因敲除小鼠。

c-MYB基因及microRNA-150基因在结外NK/T细胞淋巴瘤中表达及临床意义

目的研究结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL)组织中c-MYB基因及microRNA-150基因的表达水平及其相关性。方法收集本院2010年1月至2014年6月经病理组织学及免疫组织化学证实且临床资料完全的ENKTCL病理标本21例,10例增生性淋巴结炎作为对照。用免疫组织化学Maxvision法和实时荧光定量PCR法,分别检测21例ENKTCL和10例增生性淋巴结炎组织中c-MYB蛋白和microRNA-150表达水平,并进行分析与比较。结果 ENKTCL组c-MYB表达率为57%,显著高于增生性淋巴结炎组10%(P<0.05),但c-MYB过表达与患者的年龄、性别、Ann Arbor分期、国际预后指数评分无关(P>0.05)。ENKTCL组织中MicroRNA-150表达与c-MYB表达呈显著负相关(P<0.05)。结论 MicroRNA-150可能通过靶向调控c-MYB基因表达参与了ENKTCL的发生与发展。

MicroRNA-150在结膜黏膜相关淋巴组织淋巴瘤增殖、迁移及侵袭中的作用

目的观察结膜黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤中microRNA-150(miR-150)的表达,探讨miR-150在结膜MALT淋巴瘤中影响肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的机制。方法使用qPCR法检测第二军医大学长征医院收治的3例结膜MALT淋巴瘤患者肿瘤组织及瘤旁组织中miR-150及其可能的下游靶分子Cbl-b的表达。将miR-150抑制物和阴性对照转染人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226,采用CCK-8法和流式细胞术研究miR-150对RPMI 8226细胞增殖和凋亡的影响,通过Transwell实验研究miR-150对RPMI 8226细胞迁移和侵袭的影响,用蛋白质印迹法检测miR-150对RPMI 8226细胞中Cbl-b表达的调控。结果与瘤旁组织相比,结膜MALT淋巴瘤组织中miR-150表达上调(P<0.05,P<0.01);抑制miR-150后,RPMI 8226细胞的增殖受到抑制,细胞凋亡明显增加,迁移和侵袭能力降低,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。在结膜MALT淋巴瘤组织中,miR-150下游靶基因Cbl-b表达下调(P<0.01);抑制miR-150后,RPMI 8226细胞内Cbl-b蛋白的表达上调(P<0.01)。结论 MiR-150对淋巴瘤细胞的增殖、迁移和侵袭有促进作用,其表达上调参与了MALT淋巴瘤的发生。其机制可能与miR-150对下游分子Cbl-b的抑制性调控有关。

MicroRNA-150通过下调MUC4抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭

目的探讨microRNA-150(miR-150)与宫颈癌细胞生物学功能的相关性。方法收集宫颈癌/癌旁配对样本23例,培养宫颈癌细胞系SiHa细胞、HeLa细胞、miR-150 mimics干预细胞。生物信息学分析,确定miR-150靶标,双荧光素酶报告基因检测进行验证;RT-qPCR及Western blot检测miR-150、MUC4表达;CCK-8检测细胞增殖;AO-PI染色后荧光倒置显微镜下,观察细胞自噬;Transwell检测细胞迁移。结果在宫颈癌组织及SiHa、HeLa细胞中,miR-150表达显著下调,MUC4表达显著上调;荧光素酶报告基因检测证实MUC4是miR-150的直接靶标;miR-150过表达后MUC4表达显著降低,SiHa细胞增殖、迁移侵袭能力显著降低,且细胞凋亡增加;miR-150过表达与细胞自噬相关。结论miR-150可能通过下调MUC4表达抑制宫颈癌细胞的恶性生长和侵袭行为,这可能为宫颈癌的诊断和治疗策略提供新方法。

姜黄素通过调控microRNA-7641及其靶基因p16抑制膀胱癌T24细胞增殖的机制研究

目的确定可能导致膀胱癌的mi RNAs,并研究其在姜黄素抗癌作用中的机制。方法对T24和SV-HUC-1细胞进行了芯片测序和q PCR分析。检测mi R-7641在含姜黄素或不含姜黄素的T24和SVHUC-1细胞株中的潜在致瘤性。并使用蛋白质印迹分析p16是mi R-7641在T24细胞中作用的重要靶基因。结果姜黄素诱导mi R-7641的表达下调及p16的上调,而p16是mi R-7641的转录后水平靶点之一,从而导致膀胱癌细胞凋亡增加。结论研究表明姜黄素可能是治疗无肌肉浸润性膀胱癌的临床治疗的潜在有效药物。

降钙素基因相关肽通过调节microRNA-1和microRNA-133a的表达抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡(英文)

目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对心肌细胞凋亡的抑制作用及其潜在的机制。方法:异丙肾上腺素(10-5 mol/L)孵育48 h以诱导体外培养的大鼠心肌细胞凋亡,不同浓度的CGRP(10-8或10-7mol/L)在异丙肾上腺素孵育前1 h给药。药物处理结束后,检测心肌细胞凋亡率和细胞内活性氧的水平以及microRNA-1和microRNA-133a表达的变化。结果:异丙肾上腺素能显著增加心肌细胞的凋亡和细胞内活性氧的产生,同时伴随着microRNA-1表达的上调和microRNA-133a表达的下调,预先给予CGRP可显著抑制异丙肾上腺素的上述效应,但CGRP的有益效应可被CGRP受体拮抗剂所取消。结论:CGRP可抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制活性氧的产生进而调节microRNA-1和microRNA-133a的表达有关。

MicroRNA-150通过降低CD122的表达调控NK及NKT细胞的分化

目的:探讨microRNA-150缺失对调节性T细胞(Treg)、γδT细胞、NK及NKT细胞产生、发育和自稳的影响。方法:采用microRNA-150基因敲除小鼠;Real-time PCR检测microRNA-150的表达;流式细胞术检测小鼠胸腺和脾脏Treg、γδT细胞、NK及NKT细胞数量变化;采用Annexin V染色法检测细胞凋亡;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)掺入法检测细胞增殖。结果:microRNA-150缺失对小鼠Treg和γδT细胞的产生和发育不发挥明显作用,但导致NK和胸腺NKT细胞数量显著降低,而且,microRNA-150缺失导致小鼠NK及NKT细胞中CD122的表达显著降低,细胞发育受阻,凋亡增加,同时NK细胞的增殖能力也显著降低。结论:microRNA-150调控小鼠NK和NKT细胞的发育和自稳,CD122可能在以上调控过程中发挥重要作用。

肝细胞癌中microRNA-375调控的基因网络分析

目的:探讨肝细胞癌中miR-375的表达及其调控的相关靶基因和信号通路。方法:采用原位杂交检测miR-375在人肝癌组织芯片的表达情况;人全基因组表达谱芯片检测4株肝癌细胞株;MAS生物信息学软件筛选miR-375调控靶基因及相关信号通路。结果:原位杂交结果显示miR-375在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05);人全基因组表达谱芯片结果分析显示4株转染miR-375的肝癌细胞的共上调基因有20个,共下调基因有17个;MAS生物信息学软件分析显示4株转染miR-375的肝癌细胞共有的上调信号通路有54条,下调信号通路有48条。结论:miR-375与肝细胞癌有密切的关系。对miR-375调控的肝细胞癌相关靶基因与信号通路进行多元化筛选,为后续全面深入的研究肝细胞癌发生发展的机制提供了便利。

MicroRNA-150-5p对肝细胞癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的研究microRNA-150-5p(miR-150-5p)在人正常肝细胞和肝细胞癌细胞中的表达,及其对肝细胞癌细胞增殖、凋亡和周期的影响及潜在机制。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各处理组细胞中的miR-150-5p的表达水平;MTT法检测miR-150-5p对肝细胞癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-150-5p对肝细胞癌细胞凋亡和周期的影响;荧光素酶报告基因实验检测锌指蛋白609是否为miR-150-5p的直接靶基因。结果 miR-150-5p在肝细胞癌细胞系中的表达较人正常肝细胞细胞系降低,miR-150-5p可抑制肝细胞癌细胞的增殖,促进肝细胞癌细胞的凋亡,并阻滞细胞周期于G_1期。miR-150-5p在肝细胞癌中发挥肿瘤抑制分子作用的潜在机制为直接靶向抑制ZNF609的表达。结论 miR-150-5p在肝细胞癌细胞中表达降低,并可通过调控ZNF609的表达而调控肝细胞癌细胞增殖、凋亡和周期。

MicroRNA-150对NK/T细胞淋巴瘤组织和NK-92细胞辐射敏感性的影响

目的:探讨microRNA-150(miR-150)对NK/T细胞淋巴瘤组织和NK-92细胞辐射敏感性的影响。方法:选取2010年1月至2016年1月在南方医科大学珠江医院收治的NK/T细胞淋巴瘤患者36例为研究对象,并收集患者的组织标本。所有患者均接受放疗并采用淋巴瘤国际工作组标准((IWG)评价患者的近期疗效,根据疗效分为完全缓解(CR)组和未完全缓解组(NonCR)。实时荧光定量PCR检测患者肿瘤组织及NK/T细胞淋巴瘤细胞系中miR-150的表达量,向淋巴瘤NK-92细胞转染miR-150 mimics,利用MTT法和集落形成实验分析过表达miR-150对NK-92细胞辐射敏感性的影响,流式细胞术检测转染过表达miR-150对NK-92细胞辐射致凋亡的影响,Western blotting实验检测miR-150对凋亡相关蛋白Caspase3和PARP表达的影响。结果:根据IWG标准,12例患者CR,24例患者为Non-CR;与CR组相比,Non-CR组患者miR-150表达量普遍下调(P<0.05)。与正常对照s CD3-CD56^+NK细胞相比,NK/T细胞淋巴瘤组织(9.10±0.19 vs 4.01±0.22,P<0.01)和5种NK/T细胞淋巴瘤细胞系中miR-150呈明显低表达(P<0.05)。过表达miR-150可明显降低辐射后NK-92细胞的增殖能力(P<0.01)和集落形成能力(P<0.01),明显提高NK-92细胞的辐射增敏比(10 Gy时辐增敏比为5.375),显著促进辐射诱导的NK-92细胞的凋亡[(37.3±1.24)%vs(28.3±2.34)%,P<0.05],可促进激活的Caspase 3和PARP蛋白表达。结论:miR-150在NK/T细胞淋巴瘤组织标本及体外培养细胞系中的表达呈显著低水平,miR-150表达量低的患者放疗后缓解率低;转染miR-150 mimics能够增强辐射对NK-92细胞增殖的抑制作用和促进辐射诱导致凋亡作用,对NK/T细胞淋巴瘤有辐射增敏作用。

MicroRNA-218下调肝细胞癌中的E2F2基因表达抑制细胞增殖的研究

目的探讨MicroRNA-218(miRNA-218)下调肝细胞癌中的E2F2基因表达,从而抑制细胞增殖的机制。方法从细胞库中取得人类肝癌细胞株HepG2、Huh7、MHCC-97H、BEL-7402和正常肝细胞株L02。随后进行细胞培养和转移、反转录多聚酶链反应、免疫印迹分析、细胞增殖和集落形成试验、细胞周期分析和相应的统计学处理。结果 miR-218表达水平在癌细胞中下调。MTT生长曲线表明,当miR-218过度表达时(Huh7中的miR-218 P=0.001;在MHCC-97中的miR-218 P=0.013)细胞增殖能力明显降低。双荧光素酶实验证实,转染了miRNA-218模拟物的细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.01),荧光酶报告基因含有E2F2野生型的第3′非翻译区。这些结果表明E2F2是miR-218的直接作用对象。与阴性对照组相比,转染了miR-218模拟物的Huh7和MHCC-97细胞株中的E2F2的相对mRNA表达显著下调(P<0.05)。结论 miR-218通过直接作用于E2F2基因的第3′非翻译区调节E2F2的表达,从而抑制HCC细胞增殖。

MicroRNA-218靶向神经元表达发育下调基因9对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的观察microRNA-218(miR-218)对胃癌细胞SGC-7901增殖和侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养人胃癌细胞SGC-7901,将对数生长期细胞分为空白对照组、阴性对照组和miR-218 mimics组,阴性对照组和miR-218 mimics组细胞分别转染阴性对照序列和miR-218 mimics,空白对照组细胞不进行转染。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测3组细胞中miR-218表达,细胞计数试剂盒-8检测3组细胞培养24、48、72、96 h时的增殖活性;平板细胞克隆形成实验检测3组细胞克隆能力;Transwell实验检测3组细胞侵袭能力;Western blot法检测3组细胞中神经元表达发育下调基因9(NEDD9)蛋白、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)的表达。将SGC-7901细胞分为阴性对照组+NEDD93′非编码区(3′UTR)-Wt组(阴性对照序列、pCHECK2-NEDD93′UTR-Wt共转入SGC-7901细胞)、miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Wt组(miR-218 mimics、pCHECK2-NEDD93′UTR-Wt共转入SGC-7901细胞)、阴性对照组+NEDD93′UTR-Mut组(阴性对照序列、pCHECK2-NEDD93′UTR-Mut共转入SGC-7901细胞)、miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Mut组(miR-218 mimics、pCHECK2-NEDD93′UTR-Mut共转入SGC-7901细胞),常规培养48 h后收集各组细胞,采用发光检测仪测定各组细胞中荧光素酶活性,分析miR-218与NEDD9的靶向关系。结果与空白对照组和阴性对照组比较,miR-218 mimics组细胞中miR-218表达及培养24、48、72、96 h时细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05),NEDD9蛋白表达及细胞克隆形成数量和侵袭细胞数量显著减少(P<0.05);空白对照组与阴性对照组细胞中以上各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Wt组细胞中荧光素酶活性显著低于阴性对照组+NEDD93′UTR-Wt组、阴性对照组+NEDD93′UTR-Mut组和miR-218 mimics+NEDD93′UTR-Mut组(P<0.05)。与空白对照组和阴性对照组比较,miR-218 mimics组细胞中E-cadherin蛋白表达显著升高,vimentin、N-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组细胞中E-cadherin、vimentin、N-cadherin蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论miR-218过表达胃癌细胞SGC-7901中NEDD9蛋白表达显著下调,microRNA-218可能通过靶向下调NEDD9表达而抑制SGC-7901细胞的增殖及侵袭能力。

人巨细胞病毒pp150基因的原核表达及抗原性分析

①目的 构建人巨细胞病毒 (HCMV) pp15 0的原核高效表达系统 ,制备用于急性、活动性HCMV感染血清学诊断的基因工程抗原。②方法 PCR扩增HCMVpp15 0抗原决定簇 (84 0～ 10 4 8aa)编码基因片段 ,分别插入原核表达载体 pMAL p2、pET 2 8a ,转化宿主菌E .coli.诱导表达 ,经麦芽糖亲和层析树脂纯化 ,以Western Blot及间接ELISA法鉴定其抗原性。③结果 重组表达质粒 pMAL p2 pp15 0可在E .coli.DH5α中有效表达 ,表达产物经SDS PAGE电泳后 ,凝胶成像系统分析显示相对分子质量约为 6 .4万 ,约占菌体蛋白的 10 %。而重组质粒pET 2 8a pp15 0未见明显表达带。Western Blot检测 ,阳性识别率为 80 % (12 / 15 )。用此蛋白包被ELISA板 ,检测正常孕妇血清 ,阳性率为 6 .5 % (17/ 2 6 3)。与本室制备的全病毒抗原ELISA的诊断符合率为 96 %。④结论此重组蛋白具有良好的抗原性 ,进一步完善后可用于HCMV急性和活动性感染的诊断。

MicroRNA-3666调节白血病细胞PTEN基因的表达

目的:探讨白血病细胞中microRNA-3666(miR-3666)对第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)表达的调控作用。方法:qRT-PCR检测miR-3666在正常人外周血单个核细胞、不同类型白血病细胞系以及临床初诊未治的不同类型白血病细胞中的表达差异,利用TargetScan在线分析软件预测miR-3666潜在靶基因PTEN后,构建含有靶基因野生型3’端非翻译区域(3’UTR)及突变型3’UTR(缺失了整段预测的miR-3666结合序列)的双萤光素酶报告基因质粒,采用脂质体Lipofectamine 2000包裹双萤光素酶重组质粒及miR-3666模拟体或阴性对照,共转染HEK293T细胞,应用双萤光素酶检测试剂盒测定萤光素酶活性。FAM标记的miR-3666抑制体和阴性对照分别核转染至K562细胞,FACS检测转染效率,并采用Western blotting检测PTEN蛋白的表达。结果:miR-3666在人白血病细胞系及原代白血病细胞中的表达明显高于正常人外周血单个核细胞,尤其高表达于K562细胞系及原代慢性粒细胞白血病细胞中;双萤光素酶报告基因测定系统验证PTEN是miR-3666的潜在靶基因;K562细胞中下调miR-3666后,Western blotting检测结果显示PTEN蛋白显著上调。结论:白血病细胞中miR-3666的表达上调,下调miR-3666后可以促进靶基因PTEN的表达,miR-3666有可能成为白血病治疗的新靶点。

miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纤维化中的表达及靶基因的生物信息学分析

目的通过对miR-150-5p进行靶基因预测及生物信息学分析,为miR-150-5p靶基因相关实验验证提供数据支持,并为深入研究miR-150-5p在非酒精性脂肪性肝纤维化中的调控机制及生物学功能提供理论指导。方法将健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,模型组10只采用胆碱-蛋氨酸缺乏饲料喂养制备非酒精性脂肪性肝纤维化模型,正常组10只采用胆碱-蛋氨酸充足的饲料喂养,均饲养8周。采用microRNA(miRNA)芯片检测2组小鼠肝组织中miR-150-5p表达水平,选择TargetScan、PicTar及miRanda靶基因预测软件预测miR-150-5p靶基因的交集作为分析的基因集合,分别进行功能富集分析,应用DAVID数据库进行靶基因信号转导通路富集分析。结果模型组小鼠肝组织中miR-150-5p表达水平显著高于正常组(P<0.05),miR-150-5p靶基因集合分别富集在ATP结合、嘌呤核苷酸结合以及蛋白酶的活性等分子功能(P均<0.05),主要参与磷脂代谢、蛋白质氨基酸的磷酸化和去磷酸化、血管再生与重建及促凋亡等生物学过程(P均<0.05),靶基因信号转导通路显著富集于胰岛素信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路等信号转导通路中。结论miR-150-5p参与了非酒精性脂肪性肝纤维化发生发展过程,为非酒精性脂肪性肝纤维化新型诊断标志物与治疗靶点的研究提供了理论依据。

绵羊miR-150靶基因预测及生物信息学分析

为探究miR-150在绵羊卵巢中的调控机制,本研究利用生物信息学方法对miR-150进行靶基因预测与分析。通过miRBase数据库获取miR-150成熟序列,进行序列比对和保守性分析;利用Ensemble数据库搜索miR-150前体序列,并利用PROMO在线软件对其上游2000 bp的启动子区进行转录因子结合位点预测;通过TargetScan和miRwalk在线软件预测并取靶基因的交集,采用DAVID和KOBAS在线软件对预测靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用Networkanalyst在线软件对靶基因进行功能性蛋白的互作分析,绘制miR-150靶基因参与的调控网络;利用YM500V2在线软件分析miR-150靶基因在不同组织和疾病中的差异表达水平。结果显示,miR-150成熟序列在不同物种间具有高度保守性;miR-150启动子区存在p53、ID1、FOXO4等转录因子结合位点。GO功能分析结果显示,主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程,锌离子结合、DNA结合、转录DNA模板等分子功能,以及核、核质、胞质、胞质核周区域等细胞组分。KEGG通路富集结果显示,主要富集在癌症通路、癌症中蛋白聚糖、人乳头瘤病毒感染、乳腺癌、调节干细胞多能性等信号通路。miR-150靶基因互作分析发现,靶基因PIK3R1、PIK3CB、CTNNB1与其他蛋白存在较多靶向关系,参与了雌激素信号通路、细胞衰老、磷脂酰肌醇信号系统、TGF-β等通路。根据YM500V2在线软件分析miR-150在不同组织和疾病中的表达发现,在血液中表达水平最高,在卵巢、胰腺、淋巴和皮肤中表达水平相对较高,在脑和肾上腺皮质中表达水平很低或不表达。通过对绵羊miR-150靶基因的生物信息学分析,为其功能和调控机制研究提供参考依据,为绵羊miR-150在卵巢发育中的调控机制奠定基础。

MicroRNA-34a影响宫颈癌细胞增殖及PTEN基因表达的研究

目的探讨microRNA-34a对宫颈癌细胞增殖及抑癌基因PTEN表达的影响。方法 Hela细胞株传代培养后分为上调组、下调组和对照组,分别转染microRNA-34a模拟物、抑制物和对照物,48 h后用CCK-8、定量PCR、Western blot法检测细胞增殖及PTEN mRNA、蛋白表达。采用生物信息软件预测microRNA-34a靶基因。结果上调组Hela细胞增殖比对照组降低23.43%(P<0.01),而下调组比对照组增加14.77%(P<0.01)。上调组PTEN mRNA和蛋白表达升高(P<0.01),而下调组表达降低(P<0.05)。靶基因预测分析显示microRNA-34a与PTEN基因mRNA的3UTR区无互补结合区。结论 microRNA-34a抑制宫颈癌细胞增殖,可能与促进抑癌基因PTEN表达有关。

MicroRNA-122过表达转基因小鼠的建立

目的:建立microRNA-122(mir-122)过表达转基因小鼠模型,为今后研究肝脏发育,分化及肝癌预防、诊断及治疗等提供实验模型。方法:构建mir-122过表达载体,利用受精卵前核显微注射法将mir-122过表达载体导入小鼠受精卵中,获得mir-122过表达转基因小鼠。PCR法检测转基因小鼠的整合情况,实时定量PCR法检测mir-122过表达转基因小鼠肝脏及其主要器官mir-122及其确定靶基因高亲和性阳离子氨基酸转运体-1(CAT-1),切割同源物1(CUTL-1),血清反应因子(SRF)的表达情况。结果:mir-122过表达转基因小鼠,与同窝阴性鼠相比,mir-122在过表达转基因小鼠肝脏及主要器官中的表达升高,mir-122靶基因表达水平下降。结论:成功构建mir-122过表达转基因小鼠。

MicroRNA-122调控的TK基因有效降低TK/GCV治疗系统的肝毒性

目的:探讨利用肝脏特异性microRNA-122(miR-122)调控外源基因在肝细胞的表达,减轻单纯疱疹病毒1型胸苷激酶和更昔洛韦(herpes simplex virus type 1-thymidine kinase/gancyclovir,TK/GCV)治疗系统的肝毒性。方法:通过在相应基因的3′非翻译区(3′UTR)插入miR-122靶序列,构建miR-122调控的pEGFP-122T、pLuc-122T和pTK-122T表达载体,分别转染miR-122阳性的Huh7肝癌细胞和miR-122阴性的HeLa宫颈癌细胞,观察细胞中报告基因的表达及TK/GCV的细胞毒杀伤作用。水动力法分别注射上述质粒至小鼠体内,冰冻切片和活体成像观察肝脏EGFP和Luc的表达,通过小鼠血清ALT、体质量变化、存活率和肝脏病理变化评价TK/GCV系统的肝毒性。结果:在Huh7细胞,miR-122靶序列的插入抑制了EGFP的表达和Luc的活性,减轻TK/GCV的毒性杀伤;而在HeLa细胞,miR-122靶序列的插入对报告基因表达和TK/GCV的杀伤无影响。体内实验结果显示,pEGFP-122T处理组的肝细胞不表达EGFP,而pEGFP处理组的肝细胞有30%高表达EGFP;与pLuc处理组相比,pLuc-122T处理组的Luc活性下调了33.70%。pTK处理组小鼠血清ALT显著升高、体质量进行性下降、肝脏出现明显病理损伤,进而引起小鼠死亡;而pTK-122T处理组小鼠血清ALT正常、无体质量下降、肝脏切片未见病理改变。结论:miR-122靶序列的插入可抑制外源基因在肝脏的表达,并可有效地降低TK/GCV系统的肝毒性。

microRNA-150在心房颤动患者心房组织中的表达及其对大鼠H9c2心肌细胞的影响

目的:探讨microRNA-150在心房颤动患者心房组织中的表达及其对大鼠H9c2心肌细胞的影响。方法:选择行风湿性心脏病瓣膜置换术心房颤动患者的心房组织(30例)作为心房颤动组,行风湿性心脏病瓣膜置换术窦性心律患者的心房组织(30例)作为对照组。将H9c2心肌细胞分为microRNA-150组(转染p GIPZ-miR-150慢病毒)、阴性对照组(转染p GIPZ慢病毒)和空白对照组(未转染病毒)。采用RT-PCR测定组织和细胞中microRNA-150表达和c Myb mRNA水平;采用Western blotting测定细胞中c Myb蛋白、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平;采用ELISA法测定细胞中胶原Ⅰ水平。结果:心房颤动组心房组织中microRNA-150的相对表达量低于对照组(P<0.05)。microRNA-150组H9c2心肌细胞中microRNA-150表达量明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),c Myb mRNA和蛋白水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),胶原Ⅰ水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),MMP-9和TGF-β1水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);阴性对照组和空白对照组H9c2心肌细胞中各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:心房颤动患者心房组织中microRNA-150表达量下降,上调心肌细胞中microRNA-150表达量可通过靶基因c Myb降低心肌细胞纤维化。