miR-449c通过抑制c-Myc的表达抑制肺腺癌细胞周期进程

目的:探讨miR-449c对肺腺癌发生发展的影响及可能机制。方法:利用生物信息学分析鉴定高复发风险肺腺癌患者(无病生存期≤6个月)与低复发风险患者(无病生存期>60个月)之间差异表达的microRNA(miRNA)。靶基因预测及通路分析研究可能的机制。RT-PCR检测miR-449c在肺腺癌组织和细胞系中的表达,利用细胞转染实验在肺腺癌细胞系中过表达miR-449c和c-Myc,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,蛋白质印迹分析检测相关蛋白表达水平。结果:生物信息学分析结果显示,相比低复发风险患者,肺腺癌高复发风险患者的miR-449c表达显著降低。miR-449c表达水平与肺腺癌患者临床分期和淋巴结转移相关,miR-449c低表达患者的预后显著差于高表达患者。通路和功能分析表明,miR-449c可能与细胞周期进程有关。与癌旁组织相比,miR-449c在肺腺癌组织中显著低表达;过表达miR-449c抑制了肺腺癌细胞增殖,导致细胞周期阻滞于G1期,下调了c-Myc及其下游细胞周期蛋白的表达。c-Myc过表达可部分逆转miR-449c对细胞周期蛋白的抑制,miR-449c过表达也可部分逆转c-Myc对细胞周期蛋白的上调。结论:miR-449c低表达的肺腺癌患者预后较差,过表达miR-449c可以通过下调c-Myc调控细胞周期,抑制肺腺癌细胞增殖,提示miR-449c可能作为肺腺癌潜在的治疗靶标之一。

冠心病病人DDAH2基因-449G/C多态性对血浆ADMA水平的影响

目的分析冠心病病人二甲基精氨酸二甲胺水解酶2(DDAH2)基因-449G/C多态性及对血浆非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平的相关性。方法选取2016年12月—2018年12月在我院心内科住院行冠状动脉造影术病人412例,根据造影结果分为冠心病组(212例)及对照组(200例)。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测两组DDAH2基因-449G/C多态性;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定两组血浆ADMA水平,并将冠心病组病人按年龄分为5组,检测各组血浆ADMA水平。结果冠心病组血浆ADMA水平高于对照组(P<0.05);冠心病组血浆ADMA水平与年龄呈正相关(r=0.479,P<0.05)。结论DDAH2基因遗传多态性(-449G/C,rs805305)与冠心病病人血浆ADMA水平相关,且ADMA水平与年龄呈正相关。

稳定高表达miR-449c的5637膀胱癌细胞株的建立

目的构建稳定表达miR-449c的人膀胱癌细胞株。方法以HEK293细胞基因组DNA作为模板,采用高保真酶进行扩增得到pre-miR-449c序列,将所得目的片段克隆到Ftet UGW-T载体上;经测序鉴定后,感染5637人膀胱癌细胞;经嘌呤霉素筛选后,利用倒置荧光显微镜观察筛选后的细胞增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达强度,采用荧光实时定量PCR检测miR-449c的表达,Western blot法检测其下游靶基因C-myc蛋白的水平。结果成功构建了Ftet UGW-T/miR-449c慢病毒载体,慢病毒包装后感染5637人膀胱癌细胞成功表达EGFP,感染后的细胞中高表达miR-449c,在稳定表达的膀胱癌细胞中C-myc蛋白表达较对照组显著降低。结论成功构建了稳定高表达miR-449c的5637膀胱癌细胞株。

bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的序列保守性、转录因子和靶基因进行生物信息学预测和分析,探究其影响精子发生的作用机制,为研究其生物学功能及作用机制提供指导和思路。【方法】利用miRBase数据库获取不同物种的bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c序列并进行相似性分析;通过TargetScan、miRWalk、miRDB等方法预测bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因,对获得的靶基因集合分别进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过AnimalTFDB获取共同调控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的转录因子,并构建TF-miRNA-mRNA作用网络。【结果】bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c在不同物种间高度保守。预测得到2个转录因子和49个候选靶基因,这些靶基因主要富集在精子发生、钙离子依赖性胞吐的调节、胰岛素分泌的调节等GO条目,以及HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、Wnt信号通路等KEGG通路。bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c与上游转录因子NR2C2和HIC1,下游靶基因AXL、E2F3、DAAM1等共同构成的作用网络通过调控减数分裂、细胞周期、细胞凋亡、精子细胞能量代谢等生物过程影响精子发生。【结论】bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c通过上游转录因子和下游靶基因组成的分子调控网络共同调节精子发生过程。

非小细胞肺癌组织中miR-449a/b/c的表达及临床意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中微小RNA(miRNA)-449a/b/c的表达水平、临床意义及与预后的关系。方法收集2013年1月至2015年12月收治的82例手术切除的NSCLC组织及69例癌旁组织标本,采用荧光实时定量PCR(QPCR)法检测以上组织中miR-449a/b/c的表达并比较3者在NSCLC组织及癌旁组织中的分布差异,Pearson相关分析NSCLC组织中miR-449a、miR-449b和miR-449c表达的相关性,分析NSCLC组织中miR-449a/b/c表达与临床病理特征(性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、组织学类型和淋巴结转移)的关系,同时根据随访数据比较不同miR-449a/b/c表达患者的预后情况。结果 QPCR结果显示,NSCLC组织中miR-449a、miR-449b和miR-449c的平均表达量依次为0.210±0.028、0.359±0.031和0.133±0.020,均低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);NSCLC组织中miR-449a、miR-449b和miR-449c的表达均呈正相关,相关系数r_(miR-449a/b)、r_(miR-449a/c)和r_(miR-449b/c)分别为0.246、0.390和0.331(P<0.05);NSCLC组织中miR-449a/b/c表达均与TNM分期有关,miR-449a和miR-449c表达与肿瘤大小有关。全组中位总生存期(OS)为12.4个月,其中miR-449a低表达组和高表达组的中位OS分别为11.2个月和13.5个月(P>0.05),miR-449b低表达组和高表达组的中位OS分别为9.6个月和14.2个月(P<0.05),miR-449c低表达组和高表达组的中位OS分别为11.7个月和13.7个月(P>0.05)。结论miR-449a/b/c在NSCLC组织中表达降低,且均与TNM分期有关,miR-449b表达与预后有关,可能与NSCLC发生、发展有关,对NSCLC诊断及病情评估有一定价值。

基于转录组学分析miR-34b/c与miR-449对小鼠输出小管结构与功能的影响

目的:研究miR-34b/c、miR-449在维持输出小管正常结构与功能中发挥的作用,探索miR-34b/c^(-/-)、miR-449^(-/-)双敲除小鼠不育的分子机制。方法:HE染色对小鼠输出小管形态进行观察;利用转录组测序技术对野生型小鼠和miR-34b/c^(-/-)、miR-449^(-/-)双敲除小鼠输出小管基因表达进行分析,从中筛选出miR-34b/c、miR-449可能的靶基因与差异表达基因进行联合分析;qRT-PCR法验证测序结果。结果:双敲除小鼠输出小管形态异常;与野生型小鼠相比,双敲除小鼠输出小管中参与纤毛等结构形成以及水、离子、蛋白质转运等活动的基因表达显著下降。结论:miR-34b/c、miR-449的缺失导致双敲除小鼠输出小管结构异常,输出小管纤毛运动与重吸收功能障碍,导致双敲除小鼠不育。

miR-449c在胃癌中的表达

目的:检测胃癌组织中miR-449c的表达情况,探讨其与胃癌发生及预后的关系。方法:选取32例胃癌患者,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法检测癌旁组织(NGT)、胃癌组织(GC)及不同细胞株中miR-449c表达水平,Lipofectamine 2000转染法对相关细胞株miR-449 c表达进行上调和下调,MTT方法检测细胞的生长活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况;随访30个月,比较miR-449c低表达和高表达患者的生存率。结果:GC组织miR-449c表达(0.36±0.28)明显低于NGT组织miR-449c表达(1.01±0.14)(P<0.05),且AGS、SNU-1、SNU-5、SNU-16细胞miR-449c表达(0.39±0.08)、(0.33±0.07)、(0.25±0.06)、(0.22±0.04)均明显低于NGT组织(1.01±0.14)(P<0.05);miR-449c模拟物对SNU-16细胞进行转染,其miR-449 c表达水平(8.49±2.50)明显高于空质粒转染(P<0.05),第2、3 d细胞生长活力(0.80±0.10)、(0.90±0.12)明显低于空质粒转染(P<0.05),凋亡率(80.12±9.01)明显高于空质粒转染(P<0.05);miR-449c抑制物对AGS细胞进行转染,其miR-449c表达水平(3.00±0.50)明显低于空质粒转染(P<0.05),第2、3 d细胞生长活力(1.20±0.14)、(1.70±0.18)明显高于空质粒转染(P<0.05),凋亡率(8.00±1.00)明显低于空质粒转染(P<0.05);随访30个月,miR-449c高表达患者生存率50.00%明显高于miR-449c低表达者(P<0.05)。结论:miR-449c在胃癌组织中低表达,抑制细胞生长,促进细胞凋亡,其低表达可能与胃癌患者低生存率有关。