酸枣仁提取物调控miR-7b-3p/5-羟色胺1A受体表达促进骨生长

背景:前期研究发现,酸枣仁提取物通过提高脑组织5-羟色胺1A受体(serotonin 1A receptor,5-HT1AR)表达,使之与5-羟色胺结合,延长小鼠慢波睡眠,促进生长激素的分泌,从而使骨生长。5-HT1AR作为一种蛋白质,其表达丰度受到miRNA的调控。作者推测酸枣仁提取物可能通过miRNA调控5-HT1AR的表达从而发挥药物作用。目的:观察酸枣仁提取物通过干预小鼠脑组织中miR-7b-3p/5-HT1AR通路对骨骼生长的影响。方法:①将昆明种小鼠分为正常对照组、用药组(灌胃酸枣仁提取物0.320 mg/g),阳性对照组(灌胃酸枣仁皂甙0.013 mg/g)和酸枣仁提取物+5-HT1AR抑制剂组(灌胃酸枣仁提取物最后3 d同时每天侧脑室注射5-HT1AR选择性抑制剂P-MPPF 8μg),25 d后观察酸枣仁提取物对小鼠骨生长、血清生长激素水平及脑组织5-HT1AR表达的影响;②基因芯片法筛选由酸枣仁提取物引起的骨生长小鼠与普通小鼠脑组织差异表达的miRNAs,并通过PCR验证和双荧光素酶报告基因实验证实筛选的miR-7b-3p与5-HT1AR的调控关系;③体外培养小鼠脑皮质细胞并鉴定,利用Western blot法观察酸枣仁提取物对脑皮质细胞中5-HT1AR表达的影响;④将昆明种小鼠分为正常对照组、用药组、miR-7b-3p inhibitor组、用药+miR-7b-3p mimics组、阳性对照组,观察各组小鼠脑组织5-HT1AR表达及5-羟色胺与5-HT1AR结合活性;⑤将SD大鼠分为正常对照组、用药组、miR-7b-3p inhibitor组、用药+miR-7b-3p mimics组、阳性对照组,观察各组大鼠慢波睡眠的变化。结果与结论:①酸枣仁提取物可以促进小鼠体长、胫骨增长,促进生长激素分泌,提高脑组织5-HT1AR含量;②基因芯片筛选出差异表达的miRNAs个数为16个,其中上调有13个,下调有3个;生物信息学预测下调miR-7b-3p可以调控5-HT1AR表达,且双荧光素酶报告基因实验证实二者有直接调控关系;③酸枣仁提取物和沉默脑皮质细胞中miR-7b-3p表达可以引起5-HT1AR高表达;沉默miR-7b-3p后小鼠脑组织5-HT1AR表达、5-羟色胺与5-HT1AR结合活性及生长激素分泌均升高;过表达miR-7b-3p后小鼠脑组织5-HT1AR表达、5-羟色胺与5-HT1AR结合活性及生长激素分泌均降低;大鼠慢波睡眠期也相应延长或缩短。结果表明,酸枣仁提取物能够降低脑组织的miR-7b-3p水平,同时增加5-HT1AR的表达量。这种机制有助于延长慢波睡眠周期,并且促进生长激素的生成,对骨骼生长有积极影响,为使用酸枣仁提取物作为促进骨骼生长的潜在手段提供了科学依据。

miR-141-3p对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的抑制和改善作用

背景:研究表明,胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子有抑制纤维环细胞凋亡的作用。miR-141-3p微小RNA在骨髓基质细胞中随着年龄的增加而增加,且与炎症信号通路的活化存在一定关系,提示其可能成为腰椎间盘突出症的治疗靶点。目的:探究miR-141-3p通过调控胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的影响。方法:选取50只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组、miR-141-3p mimics组,每组10只。除正常组外,其余大鼠采用自体髓核移植法进行腰椎间盘突出症建模。建模成功后,对miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组和miR-141-3p mimics组大鼠鞘内分别注射10μL 20μmol/L miR-NC,miR-141-3p inhibitor,miR-141-3p mimics,均每天注射1次,连续注射28 d;正常组、模型组同期同位置注射同体积生理盐水。采用热缩足潜伏期阈值评价大鼠下肢疼痛,实时荧光定量PCR检测背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达,ELISA法检测背根神经节组织炎症因子,免疫印迹法检测背根神经节组织胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子蛋白表达,并分析miR-141-3p与胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子的相关性。结果与结论:miR-NC组各项指标与模型组比较,差异均无显著性意义。①大鼠热缩足潜伏期阈值:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。②背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。③背根神经节组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素1含量:模型组明显高于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显高于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显低于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。④背根神经节组织胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子蛋白表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。⑤胰岛素样生长因子1与miR-141-3p呈正相关(r=0.904,P<0.001),血小板源性生长因子与miR-141-3p呈正相关(r=0.879,P<0.001)。⑥结论:miR-141-3p可显著改善腰椎间盘突出症大鼠下肢疼痛,抑制背根神经节炎症,其机制可能与促进胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子表达有关。

LncRNA GATA3-AS1通过调控miR-362-3p/FABP5轴抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的:探究长链非编码RNA GATA3反义RNA 1(lncRNA GATA3-AS1)调控微小RNA-362-3p(miR-362-3p)表达对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:qRT-PCR检测宫颈癌细胞中lncRNA GATA3-AS1、miR-362-3p、FABP5表达;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA GATA3-AS1和miR-362-3p的靶向关系、miR-362-3p和FABP5的靶向关系;将细胞分为pcDNA-NC组、pcDNA-GATA3-AS1组、si-NC组、si-GATA3-AS1组、si-GATA3-AS1+inhibitor-NC组、si-GATA3-AS1+miR-362-3p inhibitor组、miR-NC组、miR-362-3p mimics组、miR-362-3p mimics+pcDNA-NC组、miR-362-3p mimics+pcDNA FABP5组;Western blot检测蛋白表达;EdU法检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移侵袭。结果:在宫颈癌细胞系中,GATA3-AS1、FABP5均为高表达,miR-362-3p均为低表达,选择HeLa细胞进行后续实验;双荧光素酶报告基因实验表明,lncRNA GATA3-AS1和miR-802、miR-362-3p和FABP5具有靶向关系;与pcDNA-NC组比较,pcDNA-GATA3-AS1组Hela细胞EdU阳性率、迁移侵袭及MMP-2、MMP-9表达明显上升(P<0.05);与si-NC组比较,si-GATA3-AS1组HeLa细胞EdU阳性率、迁移侵袭及MMP-2、MMP-9表达明显下降(P<0.05);抑制miR-362-3p表达或过表达FABP5均可以明显逆转沉默GATA3-AS1或过表达miR-362-3p对于HeLa细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论:沉默GATA3-AS1可以靶向上调miR-362-3p表达,抑制FABP5表达,抑制宫颈癌HeLa细胞增殖迁移及侵袭。

LncRNA HCG18通过靶向miR-140-3p/PD-L1通路对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨长非编码(lncRNA)HCG18通过微小RNA-140-3p(miR-140-3p)/程序性死亡受体配体1(PD-L1)对鼻咽癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法 选择人鼻咽癌CNE2细胞、人正常鼻黏膜上皮细胞HNEpC细胞,将CNE2细胞分为HCG18组、pcDNA3.1组、sh-HCG18组、sh-NC组、miR-140-3p组、miR-NC组、miR-140-3p inhibitor组、Scramble组、HCG18+miR-NC组、HCG18+miR-140-3p组、miR-140-3p inhibitor+sh-NC组及miR-140-3p inhibitor+sh-PD-L1组。用CCK-8检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测PD-L1蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测lncRNA HCG18、miR-140-3p及PD-L1 mRNA水平,生物信息学、双荧光素酶报告实验分析lncRNA HCG18、miR-140-3p及PD-L1的靶向关系。结果 CNE2细胞lncRNA HCG18、PD-L1蛋白及其mRNA表达水平高于HNEpC细胞,miR-140-3p表达水平低于HNEpC细胞(P <0.05)。上调lncRNA HCG18或下调miR-140-3p后CNE2细胞增殖、细胞迁移与侵袭能力增强,PD-L1蛋白、PD-L1 mRNA水平升高(P <0.05);下调lncRNA HCG18或上调miR-140-3p后CNE2细胞增殖、细胞迁移与侵袭能力降低,PD-L1蛋白、PD-L1 mRNA水平降低(P <0.05)。miR-140-3p与lncRNA HCG18、PD-L1均有靶向关系。上调miR-140-3p表达可逆转上调lncRNA HCG18对CNE2细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用;沉默PD-L1可逆转下调miR-140-3p对CNE2细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用。结论 过表达lncRNA HCG18可通过海绵化miR-140-3p,上调PD-L1表达,促进CNE2细胞增殖、迁移与侵袭。

miR-132-3p/CAMTA1对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠施万细胞的调控作用

目的探讨miR-132-3p通过钙调素结合转录因子1(CAMTA1)对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠(FNI)中施万细胞的调控作用。方法用I-125粒子辐射大鼠施万细胞,并在细胞中转染miR-132-3p mimic、miR-132-3p inhibitor以及sh-CAMTA1。免疫荧光检测S100B和β-TubulinⅢ荧光强度。RT-qPCR检测miR-132-3p的表达,Western blot检测CAMTA1蛋白表达。EdU染色评估细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。同时,构建FNI大鼠模型并在大鼠面部植入I-125粒子,HE、LFB染色以及IF染色评估大鼠面神经组织的病理损伤。StarBase v2.0数据库和双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p和CAMTA1的靶向关系。结果S100B和β-TubulinⅢ在大鼠施万细胞中显著表达。I-125粒子辐射组中miR-132-3p表达降低(P<0.001),抑制细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.001)。过表达miR-132-3p或敲降CAMTA1显著促进施万细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.05),敲降miR-132-3p则具有相反的作用。机制研究显示,miR-132-3p靶向负调控CAMTA1。体内实验结果显示,过表达miR-132-3p通过抑制CAMTA1的蛋白表达,减弱I-125粒子对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。结论过表达miR-132-3p抑制CAMTA1的表达,促进施万细胞的增殖和迁移,抑制I-125对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。

水飞蓟素通过调控miR-124-3p/WEE1轴影响胶质瘤细胞恶性生长的机制研究

目的探讨水飞蓟素(SM)对胶质瘤细胞恶性生长的影响以及对miR-124-3p/WEE1轴的调控机制。方法将胶质瘤U87细胞分为对照组,SM低、中、高浓度组,SM高浓度+miR-124-3p抑制剂组(SM高+miR-124-3p inhibitor组)。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blotting检测细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及凋亡相关蛋白的表达,实时定量PCR检测细胞中miR-124-3p和WEE1 mRNA水平,荧光素酶活性实验验证miR-124-3p和WEE1之间的靶向关系,建立NOD/SCID小鼠颅内移植瘤模型并进行给药和分析。结果与对照组比较,不同浓度SM处理组的细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数、cyclin D1蛋白表达、WEE1 mRNA表达水平降低,G0/G1周期细胞数、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及miR-124-3p表达升高(P<0.05);进一步转染miR-124-3p inhibitor后发现,SM对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用被逆转。小鼠体内实验显示,SM处理组肿瘤的质量和体积均低于模型组(P<0.05),且小鼠体质量无显著变化(P>0.05)。结论SM可通过上调miR-124-3p靶向下调WEE1抑制胶质瘤细胞的恶性生长。

miR-495-3p靶向BUB1调控STAT3信号通路对食管癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨miR-495-3p靶向苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1(BUB1)调控信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路对食管癌细胞生物学行为的影响。方法 使用cDNA芯片技术筛选出食管癌组织和正常组织差异表达基因,并用生物信息学方法进行分析。运用TargetScan数据库对miRNA的靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告基因检测技术进行验证。将KYSE150细胞分为空白对照组、NC mimics组和miR-495-3p mimics组。通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖活力。用流式细胞术测定细胞周期和凋亡。通过定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定BUB1 mRNA的表达水平。通过蛋白质印迹法(Western blot)测量BUB1、STAT3、磷酸化(p)-STAT3、细胞周期蛋白B1(CCNB1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和半胱氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)蛋白水平。用划痕和Transwell小室实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果 差异表达基因参与生物学过程、信号通路和网络构建主要与细胞周期相关,BUB1是关键的核心(Hub)基因,miR-495-3p靶向调控BUB1。体外实验表明,过表达miR-495-3p能显着抑制食管癌细胞的生长、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞。过表达miR-495-3p处理后,食管癌细胞中Caspase-3、Caspase-9表达量升高(P<0.01),而Bcl-2、BUB1、CCNB1、CDK1、p-STAT3表达量降低(P<0.01)。STAT3信号通路也被发现在此过程中发挥着重要作用。结论 miR-495-3p可能通过下调BUB1介导STAT3信号通路影响食管癌细胞的生物学行为。

miR-141-3p靶向调控HMGB1对LPS诱导的A549细胞损伤的影响

目的探讨miR-141-3p通过靶向调控高迁移率族蛋白1(HMGB1)对脂多糖(LPS)诱导的A549细胞损伤的影响。方法以Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,将miR-141-3p mimics、mimics NC、HMGB1基因过表达质粒(pcDNA3.1-HMGB1)和空载质粒(Vector)分别或共转染至A549细胞中,再采用10μg/ml LPS处理24 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞增殖活性;比色法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p与HMGB1之间的靶向调控关系。结果LPS干预后,A549细胞增殖活性及细胞中miR-141-3p表达水平降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及上清液中LDH活性升高(P<0.05)。过表达miR-141-3p可增强LPS处理后的A549细胞增殖活性(P<0.05),降低细胞凋亡率及细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和上清液中LDH活性(P<0.05)。然而,HMGB1基因过表达可逆转miR-141-3p对LPS诱导A549细胞损伤的改善作用。双荧光素酶报告基因实验证实,HMGB1是miR-141-3p下游靶基因。结论miR-141-3p可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡,降低炎症因子表达水平,改善A549细胞损伤,其作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。

miR-1-3p通过调控STC2抑制人食管鳞状细胞癌细胞的恶性生物学行为

目的探讨miR-1-3p对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞的恶性生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法利用基因表达数据库(GEO)筛选ESCC中差异表达的miRNA。采用qRT-PCR检测人ESCC细胞KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510和Eca109及正常食管上皮细胞HET-1A中miR-1-3p的表达水平。CCK-8试剂盒、划痕愈合和Transwell实验以及流式细胞术分别检测转染miR-1-3p mimic对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡能力的影响。使用生物信息学工具预测miR-1-3p的靶基因,Kaplan-Meier法分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中STC2表达水平与患者预后的关系。采用FISH检测miR-1-3p的亚细胞定位,双荧光素酶报告基因验证miR-1-3p与STC2的靶向关系。RNA免疫沉淀(RIP)实验检测miR-1-3phe STC2的结合。Western blot法检测转染miR-1-3p mimic对ESCC细胞中STC2及内质网应激相关蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF4表达水平的影响。CCK-8、划痕愈合、Transwell实验和流式细胞术分别检测过表达和敲低STC2对ESCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的影响。结果ESCC细胞中miR-1-3p的表达水平均低于HET-1A细胞(均P<0.05),转染miR-1-3p mimic可抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),促进ESCC细胞凋亡(均P<0.001)。生物信息学工具预测miR-1-3p的靶基因为STC2,ESCC组织中STC2的表达水平高于正常食管上皮组织,与预后呈负相关(均P<0.05)。miR-1-3p位于胞质,并可直接与STC2 mRNA结合。转染miR-1-3p mimic可下调STC2、p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白的表达水平(均P<0.05)。过表达STC2可促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),抑制ESCC细胞凋亡(均P<0.05)。敲低STC2可抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05),促进ESCC细胞凋亡(均P<0.05)。结论miR-1-3p通过靶向调控STC2抑制ESCC细胞的恶性生物学行为,促进ESCC细胞凋亡,可能是通过抑制内质网应激发挥作用。

miR-381-3p对口腔癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的调控作用及其机制

目的 观察微小RNA(miR)-381-3p对口腔癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的调控作用,并基于甲基转移酶SETDB1基因调控探讨相关机制。方法 采用RT-PCR法检测口腔癌细胞系CAL-27和正常口腔黏膜上皮细胞系ATCC中的miR-381-3p。培养CAL-27细胞,分为模拟物组、阴性对照组和未转染组,模拟物组和阴性对照组分别转染miR-381-3p模拟物和miR-381-3p阴性对照,未转染组不进行转染;采用CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,划痕愈合实验检测细胞迁移能力。采用TargetScan(http://www. targetscan. org/vert_80/)预测miR-381-3p与SETDB1结合位点,应用双荧光素酶报告基因分析进行验证;采用RT-PCR法检测CAL-27细胞和ATCC细胞中的SETDB1 mRNA,Western blotting法检测SETDB1蛋白;将CAL-27细胞分为模拟物组、阴性对照组和未转染组,模拟物组、阴性对照组分别转染miR-381-3p模拟物和阴性对照,未转染组不进行转染,采用RT-PCR法检测SETDB1 mRNA。结果 CAL-27细胞中miR-381-3p表达低于ATCC细胞(P<0.05)。模拟物组在培养12、24、36、48 h时细胞增殖能力低于阴性对照组和未转染组(P均<0.05)。模拟物组细胞迁移距离、穿膜细胞数均低于阴性对照组和未转染组(P均<0.05)。SETDB1存在连续的、可以与miR-381-3p互补的核苷酸序列;共转染SETDB1-WT和miR-381-3p质粒的CAL-27细胞相对荧光素酶活性低于其他组细胞(P均<0.05);CAL-27细胞中SETDB1mRNA和蛋白表达高于ATCC细胞(P均<0.05);模拟物组SETDB1 mRNA表达低于阴性对照组和未转染组(P均<0.05)。结论 miR-381-3p能够抑制口腔癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能与调节SETDB1表达有关。

LncRNA PURPL调节miR-342-3p/PIK3R1轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探究长链非编码RNA(PURPL)调节微小RNA-342-3p(miR-342-3p)/磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(PIK3R1)轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:细胞实验:将si-NC、si-PURPL、si-PURPL+inhibitor NC、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor分别转染至肝癌细胞Huh-7细胞并命名为si-NC组、si-PURPL组、si-PURPL+inhibitor NC组、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组,未做任何处理的Huh-7细胞记为NC组。双荧光素酶报告基因实验验证LncRNA PURPL、miR-342-3p、PIK3R1的关系;qRT-PCR检测人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Huh-7中LncRNA PURPL、miR-342-3p表达;Western blot检测L02细胞、Huh-7细胞PIK3R1蛋白水平;MTT法检测Huh-7细胞增殖情况;流式细胞术检测Huh-7细胞凋亡率;Transwell检测Huh-7细胞侵袭数量;划痕试验测定Huh-7细胞迁移。体内实验:构建裸鼠异种移植模型,分组同细胞实验,检测肿瘤体积和肿瘤重量。结果:细胞实验结果显示:与si-NC组相比,si-PURPL组Huh-7细胞OD490值、划痕愈合率、侵袭细胞数量、LncRNA PURPL、PIK3R1水平显著下降(P<0.05),Huh-7细胞凋亡率、miR-342-3p相对表达量显著升高(P<0.05),而抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL抑制Huh-7细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的效果;LncRNA PURPL负向调控miR-342-3p/PIK3R1轴。体内结果显示:si-PURPL组裸鼠肿瘤体积和质量较si-NC组下降(P<0.05);抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL对体内肿瘤生长的抑制作用。结论:沉默LncRNA PURPL可抑制Huh-7细胞的恶性生物学行为,其机制可能与调控miR-342-3p/PIK3R1轴有关。

妊娠期糖尿病孕妇血清微小RNA-29a-3p、胰岛素样生长因子-1表达水平及其对胎儿生长受限的预测价值

目的探究妊娠期糖尿病(GDM)孕妇血清微小核糖核苷酸(micro RNA,miR)-29a-3p、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达水平及其对胎儿生长受限的预测价值。方法选择2019年8月—2022年12月在本院202例就诊分娩的GDM患者(132例)及同期体检健康孕妇(70名)作为研究对象,就诊分娩的GDM患者为患病组,同期体检健康孕妇为对照组。根据GDM患者是否伴有胎儿生长受限分为GDM组和胎儿生长受限组,GDM组88例,胎儿生长受限组44例。qRT-PCR法检测血清miR-29a-3p水平,放射免疫法检测血清IGF-1表达。TargetScanHuman网站预测miR-29a-3p与IGF-1靶向关系。分析miR-29a-3p、IGF-1及其与胰岛素水平、新生儿体重、新生儿身长的相关性;Logistic回归分析GDM孕妇发生胎儿生长受限的影响因素;ROC曲线分析血清miR-29a-3p,IGF-1水平评估GDM孕妇发生胎儿生长受限的预测价值。结果患病组孕妇血清miR-29a-3p水平高于对照组,IGF-1水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);GDM组患者血清miR-29a-3p水平低于胎儿生长受限组,IGF-1水平高于胎儿生长受限组,差异有统计学意义(P<0.05);miR-29a-3p直接靶向作用于IGF-1表达;GDM组和胎儿生长受限组孕妇胰岛素、新生儿体重、新生儿身长比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。相关性分析表明,血清miR-29a-3p与IGF-1水平呈负相关(r=-0.402,P<0.05);血清miR-29a-3p水平与新生儿体重、新生儿身长呈负相关,IGF-1与新生儿体重、新生儿身长呈正相关(P<0.05)。Logistic回归分析表明,miR-29a-3p,IGF-1是GDM孕妇发生胎儿生长受限的影响因素(P<0.05)。血清miR-29a-3p,IGF-1水平联合评估GDM孕妇发生胎儿生长受限的曲线下面积(AUC)为0.877(95%CI:0.808-0.928),显著高于两指标单独检测(Z_(miR-29a-3p-联合)=2.893,P=0.004;Z_(IGF-1-联合)=2.810,P=0.005)。结论GDM孕妇血清miR-29a-3p水平上调,IGF-1水平下调,与胎儿生长受限密切相关,二者联合对GDM孕妇发生胎儿生长受限有较好预测价值。

miR-19b-3p靶向IGF-1参与绒毛膜癌发生发展的机制研究

目的探究miR-19b-3p靶向胰岛素样生长因子-1(IGF-1)参与绒毛膜癌增殖、侵袭和转移的机制。方法以人绒毛膜癌细胞系JEG-3为研究对象,A组:miR-19b-3p mimics组,B组:miR-19b-3p mimics NC组,C组:miR-19b-3p inhibitor组,D组:miR-19b-3p inhibitor NC组,E组:空白对照组。A组、B组、C组、D组按照分组情况进行相应转染,E组不做任何处理。分别用Real-time PCR和Western blot检测五组miR-19b-3p RNA和IGF-1蛋白表达水平,采用CCK-8法测定细胞增殖,采用划痕实验和Transwell小室侵袭实验测定细胞迁移和侵袭能力,并进行比较;采用双荧光素酶(Dualluciferase)报告实验验证miR-19b-3p对IGF-1的靶向关系。结果与E组的(0.98±0.13)相比,A组miR-19b-3p mRNA表达水平(2.23±0.16)明显上调,C组miR-19b-3p mRNA表达水平(0.73±0.08)明显下调(P<0.05)。与E组的(1.03±0.03)nmol/L相比,A组IGF-1蛋白表达水平(1.48±0.12)nmol/L明显上调,C组IGF-1蛋白表达水平(0.76±0.05)nmol/L明显下调(P<0.05)。72 h时,与E组的(5.03±0.14)%相比,A组细胞增殖活力(10.34±0.87)%明显增加,C组细胞增殖活力(2.42±0.13)%明显下调(P<0.05);与E组的(1.09±0.07)mm相比,A组细胞划痕迁移距离(1.45±0.08)mm明显增加,C组细胞划痕迁移距离(0.73±0.07)mm明显减少(P<0.05)。与E组的(103.00±7.00)个相比,A组侵袭细胞数(173.00±4.00)个明显增加,C组侵袭细胞数(82.00±1.00)个明显减少(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示:miR-19b-3p转染WT-IGF-1的细胞荧光素酶活性(0.57±0.08)Kat低于miR-NC的(0.95±0.06)Kat(P<0.05);miR-19b-3p转染MUT-IGF-1的细胞荧光素酶活性(0.98±0.05)Kat与miR-NC的(0.96±0.06)Kat比较无明显差异(P>0.05)。结论miR-19b-3p靶向上调IGF-1促进绒毛膜癌JEG-3细胞增殖、侵袭、迁移。

糖肾地黄汤通过调控lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴延缓糖尿病肾病进展的机制研究

目的 探究糖肾地黄汤通过调控lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴延缓糖尿病肾病进展的机制。方法 用小鼠单侧肾切除+腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)模型,选择糖尿病肾病小鼠模型组共45只小鼠,雌性CBA/J 30只,雄性DBA/2 15只,另选正常健康小鼠10只作为正常对照组。将造模的糖尿病肾病小鼠分为模型组、糖肾地黄汤高剂量组(TSDHDHD组)、糖肾地黄汤中剂量组(TSDHDMD组)、糖肾地黄汤低剂量组(TSDHDLD组),每组10只。HE染色检测小鼠的病理学变化,应用全自动生化分析仪对所获得小鼠血清空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG),甘油三酯(Triglyceride, TG),胆固醇(Cholesterol, TC)水平,RT-PCR法分析ARAP1、miR-25-3p、SGLT2、Bax/Bcl-2mRNA的表达,免疫印迹法(Westernblot, Wb)分析ARAP1、miR-25-3p、SGLT2、Bax/Bcl-2的蛋白表达。采用SPSS 23.0统计软件。结果 对照组中细胞排列致密整齐、完整,存在少量脂肪细胞(P>0.05);与对照组比较,模型组细胞结构较为散乱,且由稀疏变细,近端脂肪细胞数目增多,差异存在统计学意义(P<0.05);相比模型组,各剂量组糖肾地黄汤脂肪细胞数目下降,比较存在统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达降低(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达降低(P<0.05)。治疗前与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组模型组FBG水平升高(P<0.05),模型组与不同剂量糖肾地黄汤组相比无统计学差异(P>0.05);与治疗前相比,治疗12周后不同剂量糖肾地黄汤组模型组FBG水平均降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平降低(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平明显升高,Bax/Bcl-2mRNA水平明显降低(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平降低,Bax/Bcl-2mRNA水平明显升高(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平降低,Bax/Bcl-2mRNA水平明显升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2蛋白表达明显升高,Bax/Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2水平降低,Bax/Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2蛋白表达降低,Bax/Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 糖肾地黄汤可能通过调节lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴,从而达到延缓糖尿病肾病进展的目的。

CircBACH1调节miR-101-3p/KPNA2轴对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究环状RNA BACH1(circBACH1)靶向微小RNA-101-3p(miR-101-3p)/核转运蛋白α2(KPNA2)轴对骨肉瘤(OS)细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:qRT-PCR法分析OS组织中circBACH1和miR-101-3p表达水平。双荧光素酶检测circBACH1和miR-101-3p及KPNA2和miR-101-3p的靶向关系。在OS细胞MG-63中转染相应质粒记为si-NC组、si-circBACH1组、si-circBACH1+anti-NC组、si-circBACH1+anti-miR-101-3p组、miR-NC组、miR-101-3p mimics组、miR-101-3p mimics+pcDNA组、miR-101-3p mimics+KPNA2组。平板克隆检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞侵袭能力。Western blot法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、裂解的胱天蛋白酶-3(C-caspase-3)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达变化。小鼠移植瘤实验验证circBACH1对OS肿瘤生长及miR-101-3p/KPNA2的影响。结果:在OS组织中,circBACH1表达上调,miR-101-3p表达下调(P<0.05)。抑制circBACH1表达,可显著抑制OS细胞增殖与侵袭,诱导凋亡(P<0.05)。抑制miR-101-3p表达可促进OS细胞增殖与侵袭,抑制细胞凋亡(P<0.05)。miR-101-3p过表达可下调KPNA2表达,抑制OS细胞增殖与侵袭,诱导凋亡(P<0.05)。KPNA2过表达可以逆转过表达miR-101-3p对OS细胞增殖与侵袭的抑制作用(P<0.05)。小鼠移植瘤实验结果显示,抑制circBACH1表达,移植瘤体积及质量降低,miR-101-3p表达水平升高,KPNA2表达水平降低(P<0.05)。结论:circBACH1在OS组织中高表达,抑制circBACH1表达,可抑制OS细胞增殖与侵袭,诱导凋亡,其与调节miR-101-3p/KPNA2轴有关。

血清微小RNA-1-3p及微小RNA-182-5p联合检测对原发性肝癌诊断及预后的预测价值研究

目的:探讨血清微小RNA-1-3p(miRNA-1-3p)及微小RNA-182-5p(miRNA-182-5p)联合检测对原发性肝癌(PHC)诊断及预后的预测价值。方法:选取2021年9月—2022年9月吉林省肿瘤医院收治的PHC患者78例作为PHC组,另选取同期健康体检者50名作为对照组;另根据随访3年后患者转归将PHC组患者分为存活组(n=56)和死亡组(n=22)。分别比较各组患者的血清miRNA-1-3p、miRNA-182-5p水平,通过受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miRNA-1-3p及miRNA-182-5p联合检测对PHC预后的预测价值。结果:PHC组血清miRNA-1-3p水平低于对照组,miRNA-182-5p水平高于对照组(P<0.05)。死亡组血清miRNA-1-3p水平低于存活组,miRNA-182-5p水平高于存活组(P<0.05);死亡组、存活组miRNA-1-3p水平低于对照组,miRNA-182-5p水平高于对照组(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清miRNA-1-3p及miRNA-182-5p联合检测预测PHC预后的ROC曲线下面积为0.923,特异度为94.6%。结论:血清miRNA-1-3p及miRNA-182-5p与PHC密切相关,且联合检测对PHC预后的预测价值较高。

miR-338-3p通过靶向PPM1B促进口腔癌细胞凋亡

目的探讨miR-338-3p在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的作用及其调节细胞增殖、迁移和凋亡的机制。方法以正常口腔组织或成人牙龈成纤维细胞(HGF)作为对照组,RT-qPCR法检测OSCC组织或OSCC细胞(TSCCA,CAL-27,Tb3.1)中miR-338-3p和PPM1B mRNA的表达情况;免疫组化法检测OSCC组织与正常组织PPM1B表达量;过表达miR-338-3p后,MTT法检测OSCC细胞增殖、Annexin V-FITC-PI双染试剂盒检测OSCC的凋亡;Western blot法检测PPM1B与凋亡相关蛋白Bax和Claved-caspase 3、Bcl-2的表达;采用生物信息学软件Target scan网站和荧光素酶检测法探索miR-338-3p和PPM1B潜在的靶向关系。通过敲除和过表达PPM1B探索其对OSCC细胞增殖、迁移和凋亡的影响。结果OSCC组织和细胞中miR-338-3p表达下调,而PPM1B mRNA与蛋白水平均升高(P<0.05)。过表达miR-338-3p可抑制OSCC细胞的增殖并诱导细胞凋亡(P<0.05)。Western blot检测显示,miR-338-3p可以促进Bax和Claved-caspase 3并抑制PPM1B、Bcl-2的表达(P<0.05)。敲除PPM1B也抑制了细胞的生长并诱导细胞凋亡(P<0.05)。荧光素酶报告基因检测显示PPM1B和miR-338-3p之间有直接结合(P<0.05)。过表达PPM1B部分逆转了miR-338-3p对OSCC细胞增殖、凋亡的作用(P<0.05)。结论miR-338-3p在OSCC患者和OSCC细胞系中表达下调。过表达miR-338-3p通过靶向PPM1B,抑制OSCC细胞增殖并诱导细胞凋亡。

LINC00240调节miR-124-3p/UHRF1轴对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨LINC00240调节miR-124-3p/环指域泛素样蛋白1(UHRF1)轴对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法qRT-PCR检测食管鳞状癌(ESCC)组织与癌旁组织,ESCC细胞系(ECA109、TE-13、EC9706和KYSE-150)与正常食管上皮HET-1A细胞中LINC00240、miR-124-3p、UHRF1 mRNA表达水平;以ECA109细胞为研究对象,分组分别为shRNA-NC组(转染shRNA阴性对照)、sh-LINC00240组(转染LINC00240 shRNA)、sh-LINC00240+miR-124-3p-inhibitor组(共转染sh-LINC00240与miR-124-3p-inhibitor)、sh-LINC00240+inhibitor-NC组(共转染sh-LINC00240与inhibitor-NC),并以未经处理的ECA109细胞为对照组,Western Blot检测P21、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、UHRF1蛋白表达;CCK-8检测细胞增殖;Transwell检测细胞侵袭及迁移;双荧光素酶验证miR-124-3p与LINC00240、UHRF1关系。通过裸鼠注射ECA109细胞建立裸鼠移植瘤实验,单细胞悬液(4×10^(6)细胞/ml)用一次性无菌注射器皮下注射到裸鼠背部,并依次分为模型组、NC组、干扰LINC00240组,分离肿瘤,分析肿瘤质量及成瘤个数。结果ESCC组织及细胞中LINC00240、UHRF1 mRNA表达显著增加,miR-124-3p表达显著降低(P<0.05)。sh-LINC00240组增殖率、侵袭与迁移数、LINC00240、MMP-2、UHRF1 mRNA及蛋白表达较对照组、shRNA-NC组显著降低,P21、miR-124-3p表达显著增加(P<0.05);sh-LINC00240+miR-124-3p-inhibitor组增殖率、侵袭与迁移数、MMP-2、UHRF1 mRNA及蛋白表达较sh-LINC00240+inhibitor-NC组显著增加,P21、miR-124-3p表达显著降低(P<0.05),LINC00240表达差异无统计意义(P>0.05)。miR-124-3p与LINC00240、UHRF1具有靶向关系。干扰LINC00240组较模型组、NC组肿瘤质量、成瘤个数显著减少(P<0.05)。结论干扰LINC00240可抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭,可能与上调miR-124-3p/UHRF1轴有关。

GAS6-AS1调节miR-370-3p/SPATA2轴对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和EMT的影响

目的:探讨长链非编码RNA GAS6反义RNA1(long non-coding RNA GAS6 antisense RNA1, lncRNA GAS6-AS1)调节miR-370-3p/精子发生相关蛋白2 (spermatogenesis-associated protein 2, SPATA2)轴对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)的影响。方法:qRT-PCR、Western blot分别检测癌旁组织、卵巢癌组织、人正常卵巢上皮细胞IOSE80及卵巢癌细胞系HO-8910、SKOV3、A2780中GAS6-AS1、miR-370-3p及SPATA2蛋白表达。将SKOV3细胞分为:对照组(NC组)、 si-NC组、si-GAS6-AS1组、mimic NC组、miR-370-3p mimic组、si-GAS6-AS1+inhibitor NC组、si-GAS6-AS1+miR-370-3p inhibitor组,qRT-PCR检测细胞中GAS6-AS1、miR-370-3p表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕愈合实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭;Western blot检测SPATA2、细胞周期素D1(CyclinD1)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)表达;双荧光素酶报告基因实验检测GAS6-AS1与miR-370-3p、 miR-370-3p与SPATA2的关系。结果:在卵巢癌组织和细胞中GAS6-AS1、SPATA2蛋白高表达,miR-370-3p低表达,且在SKOV3细胞中GAS6-AS1、SPATA2蛋白表达量最高,miR-370-3p表达水平最低,因此,选择SKOV3细胞为后续研究对象。与NC组、si-NC组比较,si-GAS6-AS1组GAS6-AS1、OD450值(24 h、48 h、72 h)、划痕愈合率、侵袭细胞数、SPATA2、CyclinD1、Vimentin、N-cadherin蛋白表达降低,miR-370-3p表达、细胞凋亡率、Bax、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);与NC组、mimic NC组比较,miR-370-3p mimic组OD450值(24 h、48 h、72 h)、划痕愈合率、侵袭细胞数、SPATA2、CyclinD1、Vimentin、N-cadherin蛋白表达降低,miR-370-3p表达、细胞凋亡率、Bax、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);miR-370-3p inhibitor减弱了沉默GAS6-AS1对SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭及EMT的抑制及对细胞凋亡的促进作用。GAS6-AS1与miR-370-3p、miR-370-3p与SPATA2存在靶向调控关系。结论:沉默GAS6-AS1通过上调miR-370-3p来抑制SPATA2表达,从而抑制SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭及EMT,并促进细胞凋亡。

miR-101-3p通过靶向下调GALNT1逆转乳腺癌多西他赛耐药的分子机制

目的 探讨miR-101-3p通过靶向下调GALNT1逆转乳腺癌多西他赛(docetaxel, DTX)耐药的分子机制。方法 构建MCF-7/DTX细胞株,采用qRT-PCR检测MCF-7及MCF-7/DTX细胞株及乳腺癌患者癌组织中miR-101-3p的表达水平;向MCF-7/DTX细胞转染miR-101-3p mimics、siGALNT1、miR-101-3p inhibitor并用qRT-PCR实验评估转染效率;MTT实验用于检测调控miR-101-3p及GALNT1对MCF-7/DTX细胞DTX敏感性的影响;划痕实验用于分析转染后各组细胞迁移能力的变化;Transwell实验检测调控miR-101-3p及GALNT1后MCF-7/DTX细胞的垂直侵袭能力的改变;流式凋亡实验检测各组细胞在同一浓度DTX处理下的凋亡百分比;western blot实验检测调控miR-101-3p及GALNT1对凋亡关联蛋白及上皮间充质转化标志蛋白表达量的影响。结果 MCF-7/DTX细胞和DTX患者耐药组中miR-101-3p的相对表达量呈异常降低趋势。转染miR-101-3p mimics后,与miR-NC组相比miR-101-3p mimics组DTX敏感性明显升高,迁移和侵袭能力在高水平miR-101-3p下有所降低,同时凋亡百分比显著上升凋亡蛋白表达呈相同趋势,上皮间充质转化过程受到一定抑制。MCF-7/DTX细胞中GALNT1相对表达量较MCF-7细胞明显升高,双荧光素酶实验证实了miR-101-3p与GALNT1的靶向关系并且GALNT1表达量与miR-101-3p呈负相关。回复实验进一步分析GALNT1和miR-101-3p间的关系,低水平miR-101-3p能够逆转敲低GALNT1引起的DTX高敏感性,同时一定程度恢复敲低GALNT1引起的MCF-7/DTX细胞迁移、侵袭、凋亡及EMT的改变。结论 miR-101-3p介导MCF-7/DTX细胞的DTX敏感性可能是通过靶向GALNT1完成的。