棘孢小单孢菌耐受无机磷突变株129－P1产生的新的氨基糖苷抗生素复合物GP

庆大霉素生产菌棘状小单孢菌耐受无机磷突变株Ｍ，ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａＭｕｔａｎｔ１２９－Ｐ１产生一种新的氨基糖苷抗生素复合物ＧＰ，经分离纯化获两个单组分ＧＰＡ和ＧＰＢ。研究结果证明抗生素ＧＰＢ与紫色小单孢菌突变株Ｍ．ＰｕｒｐｕｒｅａＪＩ２０所产生的抗生素ＪＩ－２０日同质，抗生素ＧＰＡ与相模湾小单孢菌突变株Ｍ．ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓＮＲＲＬ１１００６０／３１生物转化的产物抗生素ＴＰＪ－Ｂ同质。抗生物ＧＰＡ和ＧＰＢ的抗菌谱广，除对绿脓假单孢菌外，均具有与庆大霉素相近的抗革兰氏阳性和阴性细菌的生物活性。对小鼠的急性毒性比庆大霉素低，体内治疗效果明显比庆大霉素好。ＧＰＡ和ＧＰＢ有协同抗细菌作用。

庆大霉素产生菌23-18诱变育种研究

用青霉素、超声波对庆大霉素产生菌棘孢小单抱菌23-18的孢子进行预处理，以增加其通透性，再用钻60进行辐射诱变，结合耐自身代谢产物的筛选，获得数株高产菌株，其中79，167菌株摇瓶发酵数价比亲株23－18提高20％，发酵周期缩短10h。萌种连续传五代，生产能力稳定，其发酵液用高效液相色谱分析，C组分比例符合中国药典要求。

电场诱导棘孢小单胞菌原生质体融合

以小诺霉素（Micromomicin,MCR)产生菌棘孢小单胞菌（Micromonosporaechinospora）为出发菌株，诱变筛选得到一株链霉素抗性菌株，抗性菌株的原生质体分别用紫外线照射和热处理致死，通过单亲致死原生质体融合，以链霉素为选择条件选出融合株，经摇瓶发酵并结合薄层层析扫描（ThinLayerCharamotography，TLC）分析，筛得4株MCR百分含量高于亲株的融合子，MCR百分含量达到90％，效价1076u／ml，分别比亲株提高15％和11％。

小单孢菌FIM-203产生庆大霉素A的研究

从福建武夷山森林土壤中分离到一株小单孢菌,编号为F IM-203,分类特征的初步研究表明该菌株属于棘孢小单孢菌。生物活性检测提示F IM-203的发酵液具有抗G+、G-细菌活性,发酵液经离子交换树脂提取获得的初提物含有3个组分,其中FW-203C为主要组分。理化性质和光谱学分析研究证明FW-203C与庆大霉素A(gen tam icin A)同质。

棘孢小单孢菌F-212种子移种期的控制及其对庆大霉素生物合成的影响

本文探讨了庆大霉素生产菌棘孢小单孢茼F-212的一级和二级种子的不同生长阶段的菌丝形态及其控制方法,以作为提高庆大霉素发酵单位的工艺手段。

棘孢小单孢菌启动子片段在大肠杆菌中的克隆和表达

棘孢小单孢菌是庆大霉素产生菌。棘孢小单孢菌基因调控的机理及其启动子的结构、功能的研究对提高和改造棘孢小单孢菌的抗生素产生具有深远的指导意义。本文报道了利用启动子探测质粒载体pGA46,克隆棘孢小单孢菌中能在大肠杆菌中表达四环素抗性的DNA片段,筛选具有四环素抗性的重组子。对棘孢小单孢菌中的大肠杆菌类型的启动子活性片段进行了酶切分析、分子杂交和抗性表达等研究。

小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌的原生质体诱变育种

通过对菌株产量分布参数的统计学分析，棘抱小单孢菌７４＃被选作原生质体诱变育种的出发菌株．获得小诺霉素含量为８０％的高产突变株的概率以紫外线对原生质体悬液３０秒诱变处理为最高（２２．８％），５株高产突变株的小诺霉素组份与效价平均分别比出发菌株提高３３．３％与５１．２％．初步探讨了甘氨酸对原生质体化的作用机理以及原生质体诱变与再生处理提高小诺霉素产生菌生产能力的机理．

庆大霉素产生菌的基因工程育种

研究小单孢菌产抗生素的生物合成机理,利用基因克隆方法从棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)中克隆出产庆大霉素生物合成的关键酶基因—2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因(gntB),并将其通过大肠杆菌——链霉菌穿梭质粒pIJ699转化原菌株,采用硫链丝菌素抗性基因启动子带动2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因表达,在培养条件不变的情况下重组菌产抗率较原菌株提高3.5%。

黑色素生物合成抑制剂MA-18化学结构和生物学活性的研究

从棘孢小单孢福建亚种No．80－A18（Micromonosporaechinosporasubsp，fujianen－sisNo80－A18）的发酵液中提取的黑色录生物合成抑制剂MA－18，经提取、纯化和理化性质鉴别，根据元素分析、EI－MS和13C-NMR的结果，确定其分子式为C7H7NO2，分子量137，分析1H-NMR和13C－NMR主要信号的归属．推测MA－18为苯的衍生物。MA－18抑制轮生链霉菌（Str－eptoverticilliummelosporm）80－A16在胨铁球脂培养基（ISP6）、青色链霉菌（Streptomycesglau－cus）93－5在酪氨酸琼脂培养基（ISP7）上形成黑色素，并抑制蘑菇酪氨酸酶合成黑色素蛋白。MA－18不抗真菌和大多数细菌，仅对金葡球菌有微弱作用．

棘孢小单孢菌原生质体制备条件的优化

对棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）原生质体制备条件进行了研究，研究表明：将棘孢小单孢菌的孢子接种到种子培养基培养36～48h（种液变为微红色），转接于含有0.3%Gly的抑制细胞壁合成培养基中继续培养48h，加入终浓度为15mg/ml的溶菌酶，37℃，酶解90min得到优化的原生质体制备条件，此时原生质体形成率与再生率之积最高，效果最好。

棘孢小单孢菌原生质体制备条件的优化

对棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)原生质体制备条件进行了研究,研究表明:在种子培养基中加入0.3%甘氨酸最有利于原生质体的制备,收集培养72h的棘孢小单孢菌菌丝体,在37℃下用20mg/ml溶菌酶酶解90min,此时原生质体形成率与再生率之积最高,效果最好。

棘孢小单孢菌和灰色链霉菌原生质体融合的研究

用庆大霉素产生菌——棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora 814(Gm^r,Km^r)和链霉素产生菌Streptomyces griseus No. 45(Sm^r,Lm^r)进行了原生质体融合。以抗性为选择标记,选出了融合体。其融合频率在10^(-3)—10^(-4)之间。在电镜条件下,观察了原生质体融合的详细过程,测定了融合体的产抗生素能力,其中一株融合体F106的抗生素产量比亲本菌株814高58％。用羧甲基纤维素薄层对发酵液层析表明,有一个融合体的发酵液比亲本菌株814多一个组份,但没有测出其生物活性。

庆大霉素B发酵培养基的优化

对棘孢小单孢菌产庆大霉素B发酵培养基进行优化,应用Design Expert 7.0软件设计Plackett-Burman筛选实验,筛选出硝酸钾、黄豆饼粉及氯化钴三个显著影响因素,通过正交实验对其进一步优化。确定最优的发酵培养基配方为:玉米淀粉6%,葡萄糖0.5%,玉米蛋白粉2.25%,黄豆饼粉3.5%,蛋白胨0.3%,鱼粉0.1%,硝酸钾0.02%,硫酸铵0.075%,碳酸钙0.6%,氯化钴0.001%,庆大霉素B效价可达800U/m L,比原配方提高20%。

庆大霉素及其相关产物在工业底盘细胞中的高效合成

庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素,在临床上广泛应用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染。它可由棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora产生,生物合成途径清晰。为了提高庆大霉素的产量,本文以工业菌株M.echinospora J1-020为基础,确定庆大霉素合成基因簇信息,建立了稳定的遗传操作方法。在此基础上,使用强(kasOp*)、中(rpsLp-cf)、弱(ermE*)三种强度的启动子评估磷酸转移酶GenP的最适过表达水平,构建对应attB/attP位点整合突变株YC002、YC003、YC001。摇瓶发酵结果显示,YC001、YC002、YC003菌株的庆大霉素C组分的产量较原始菌株[(1008±57)mg/L]分别提高了16.9%[(1178±39)mg/L]、30.8%[(1319±29)mg/L]和18.8%[(1198±46)mg/L];同时,结合杂质含量,在以上三株菌株中确定了中强度启动子控制genP过表达的效果最佳,以此构建对应的稳定整合在基因组上的genP过表达菌株YC004。使得庆大霉素C组分摇瓶发酵产量提高了34.5%[(1427±37)mg/L]。此外,以工业菌株M.echinospora J1-020为底盘,构建genQ敲除菌株,获得了只产生G418单一组分的菌株YC005,其摇瓶发酵产量为460 mg/L。以YC004为出发菌株,依次敲除genB4、genK,获得了只产生西索米星单一组分的菌株YC007,其摇瓶发酵产量达1046 mg/L。综上,以该工业菌株M.echinospora J1-020为底盘,借助合理的代谢工程策略有望快速获得多种氨基糖苷类抗生素的高产菌株。

庆大霉素生物合成关键酶基因在E.coli中的克隆与表达

从庆大霉素产生菌?棘孢小单孢菌基因组中扩增出参与庆大霉素生物合成的关键酶基因——2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因GntB,将其分别克隆到克隆载体pBS-T和表达载体pET-22b(+)上,并将pET-gntB转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导使GntB基因实现表达.GntB基因大小为1 193 bp,其编码的氨基酸含397个残基,约为42 kD的多肽链.

庆大霉素产生菌GntB基因的克隆与转化

根据小单孢菌产生庆大霉素的生物合成机理,利用基因克隆方法从棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)基因组中扩增出庆大霉素生物合成的关键酶基因—2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因(GntB),并将其通过大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒pIJ699转化原菌株,采用硫链丝菌素抗性基因启动子带动2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因在棘孢小单孢茵细胞中实现了转化。

卡奇霉素产生菌棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组测序及序列分析

棘孢小单胞菌(Micromonospora echinospora) ATCC 15837是一种高GC含量的革兰氏阳性稀有放线菌,能够合成烯二炔类抗肿瘤抗生素卡奇霉素(calicheamicin, CLM)。目前,还没有相关研究报道棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组序列,这限制了其代谢产物合成途径和比较基因组学等研究。本研究首次通过高通量测序技术对棘孢小单胞菌ATCC 15837进行全基因组测序,使用相关生物信息学软件对数据进行组装和注释等分析。使用Velvet软件进行组装拼接得到77个Contigs,GC含量为72.36%,基因组大小约为7.69 Mb。序列已提交至美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(登录号为NGNT00000000)。本研究首次报道了一株烯二炔类抗肿瘤抗生素卡奇霉素产生菌棘孢小单胞菌ATCC 15837的全基因组序列,分析了基因组基本特征,预测了该菌株的次级代谢产物生物合成基因簇,为后续的进一步代谢调控与合成生物学提供了理论基础。