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Detection of Antibodies against Toxoplasma gondii by ELISA with Recombinant Microneme Protein 3
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作者 JIANG Tao YAO Bao-an ZHAO Jun-long 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2009年第8期30-31,39,共3页
[Objective] To develop a new method for serodiagnosis of swine toxoplasmosis. [Method] With the purified recombinant microneme protein 3 (rMIC3) as coating antigens, an indirect ELISA was developed for detection of ... [Objective] To develop a new method for serodiagnosis of swine toxoplasmosis. [Method] With the purified recombinant microneme protein 3 (rMIC3) as coating antigens, an indirect ELISA was developed for detection of antibodies against Toxoplasma gondii. [ Result] The optimal working concentration of rMIC3 was 3. 40 ug/ml, and the optimal degree of dilution of sera was 1:160. Cross-reaction was not observed between the Toxoplasma gondii-positive sera and the positive sera against classical swine fever virus or some other pathogens. The developed ELISA had 92.56% coincidence rate with latex agglutination test. [ Conclusion] The developed ELISA is sensitive, rapid, specific and reproducible, and thus it can be applied in serodiagnosis and seroprevalence investigation of swine toxoplasmosis. 展开更多
关键词 toxoplasma gondii Recombinant microneme protein 3 Enzyme linked immunosorbent assay ANTIBODIES
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荧光蛋白报告载体观察刚地弓形虫SAGl、MIC3、ROP2鸡尾酒DNA疫苗的表达及其免疫原性的研究 被引量:6
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作者 王燕娟 曹建平 +2 位作者 孙雅雯 徐馀信 沈玉娟 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期368-371,376,共5页
目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表... 目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表达载体pShuttle-CMV-MCS-EF1α-Am Cyan,pLVX-IRES-Zsgreen及pLVX-IRES-rfp中,构建pShuttle-SAG1,pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2表达质粒。通过聚乙烯亚胺法用混合质粒转染293F细胞48 h,荧光显微镜下观察3个基因的表达情况。将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为A、B、C组,分别肌内注射生理盐水(50μl)、pShuttle+pLVX-Zsgreen+pLVX-rfp混合空质粒(2μg/μl,各17μl)、pShuttle-SAG1+pLVX-Zsgreen-MIC3+pLVX-rfp-ROP2混合重组质粒(2μg/μl,各17μl)。免疫28 d后,ELISA检测血清抗刚地弓形虫IgG抗体水平,初步评价该疫苗的免疫原性。结果从刚地弓形虫基因组成功扩增出1、1.1及1.7 kb的SAG1、MIC3和ROP2序列。成功构建了pShuttle-SAG1、pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2真核荧光表达质粒,转染293F细胞后观察到相应的蓝、绿、红报告荧光。免疫小鼠后28 d,ELISA测得A、B、C组IgG抗体的吸光度(A450值)分别为(0.620±0.029)、(0.741±0.040)、(1.561±0.131),C组显著高于A、B组(P<0.01)。结论刚地弓形虫SAG1、MIC3和ROP2基因混合重组质粒组成的DNA鸡尾酒疫苗能诱导小鼠产生良好的免疫原性,且多个荧光蛋白真核表达载体能够较好地指示目的基因的表达。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 基因重组 表面抗原 微线体蛋白 棒状体蛋白 鸡尾酒疫苗 免疫原性
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人弓形虫病重组蛋白MIC3诊断抗原纯化方法的比较 被引量:2
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作者 江涛 刘锦宏 赵俊龙 《长江大学学报(自科版)(下旬)》 CAS 2007年第3期217-219,共3页
目的:探讨人弓形虫病重组蛋白MIC3诊断抗原的纯化。方法:采用SDS-PAGE和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GST亲和层析法与复性透析法对rMIC3纯化的影响。结果:2种方法纯化的rMIC3的SDS-PAGE分析显示,目的蛋白带明显,杂蛋白带少;2种方法纯化... 目的:探讨人弓形虫病重组蛋白MIC3诊断抗原的纯化。方法:采用SDS-PAGE和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GST亲和层析法与复性透析法对rMIC3纯化的影响。结果:2种方法纯化的rMIC3的SDS-PAGE分析显示,目的蛋白带明显,杂蛋白带少;2种方法纯化的rMIC3的ELISA检测结果差异无显著性(P>0·05)。结论:大量纯化的弓形虫rMIC3为人弓形虫病诊断试剂的研制和推广应用奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫(toxoplasma gondii) mic3 纯化方法
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弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达
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作者 唐莉娜 刘涛 +2 位作者 黄雨婷 徐丽娜 卢丽丹 《山东医药》 CAS 2012年第31期11-13,共3页
目的构建弓形虫微线体蛋白(MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础。方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,... 目的构建弓形虫微线体蛋白(MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础。方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增法对重组质粒进行鉴定;应用HifectinⅡ真核细胞转染试剂将弓形虫PCDNA-MIC3真核表达质粒转染幼地鼠肾细胞(BHK),表达产物用SDS-PAGE进一步确认,ELISA法检测表达蛋白的免疫原性。结果重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1 120 bp大小相同的片段,PCDNA-MIC3能在BHK细胞中高效表达,表达产物能被弓形虫特异性血清所识别。结论成功构建了弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3。 展开更多
关键词 弓形虫微线体蛋白 真核表达质粒 PCDNA-mic3表达
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刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达 被引量:9
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作者 张燕丽 曹丽艳 +5 位作者 芦赟 苟惠天 王艳华 付宝权 李文卉 张德林 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期125-129,共5页
采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接... 采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达。Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符。表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白3 基因克隆 真核表达
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弓形虫MIC6羧基端相互作用蛋白的筛选 被引量:9
6
作者 郑斌 尹志奎 +1 位作者 何蔼 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期970-974,共5页
目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在... 目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白。制备目标蛋白的抗体,Western blot分析GST pull-down实验产物。结果 GST pull-down实验筛选到的目标蛋白的序列与弓形虫醛缩酶的序列一致;制备了醛缩酶的多克隆抗体,目标蛋白条带能被该抗体特异地识别。结论采用GST pull-down技术,初步筛选出与弓形虫MIC6C相互作用的蛋白为醛缩酶。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6羧基端 GSTpull-down 醛缩酶
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弓形虫信号转导蛋白14-3-3的高效表达及免疫学诊断的初探 被引量:3
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作者 都建 沈继龙 +4 位作者 王维 李小月 胡元生 钟政荣 刘淼 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第1期12-15,共4页
目的 构建弓形虫信号转导蛋白 14 -3- 3基因的重组质粒 ,并在E .coli中高效表达 ,用于免疫学诊断。方法 以限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pGEM T/Toxo 14 - 3- 3,获得弓形虫信号转导蛋白 14 - 3 -3编码基因片段 ,插入载体pET2 8a ... 目的 构建弓形虫信号转导蛋白 14 -3- 3基因的重组质粒 ,并在E .coli中高效表达 ,用于免疫学诊断。方法 以限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pGEM T/Toxo 14 - 3- 3,获得弓形虫信号转导蛋白 14 - 3 -3编码基因片段 ,插入载体pET2 8a ,转化E .coliBL2 1,IPTG诱导表达 ,在非变性条件下纯化融合的表达产物 ,通过Westernblot和ELISA检测其特异的免疫反应性。结果 所构建的弓形虫信号转导蛋白 14 -3 -3(rToxo 14 - 3- 3)在原核系统中的重组表达质粒 ,以 6个His融合蛋白的形式得到高效表达 ,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的 4 9 .2 %。该重组抗原经纯化能被弓形虫感染的人血清所识别。用rToxo 14- 3 -3作为抗原 ,ELISA检测弓形虫病具有高度的敏感性和特异性。结论 rToxo 14 - 3- 3在大肠杆菌中已得到高效表达 ,该重组抗原能有效检测弓形虫的感染 ,可用于弓形虫病诊断试剂盒的研制。 展开更多
关键词 弓形虫 信号转导蛋白 免疫学诊断 重组抗原 E.COLI ET ELISA检测 高效表达 诱导表达 纯化
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弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶相互作用的鉴定 被引量:3
8
作者 郑斌 尹志奎 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期883-885,890,共4页
目的鉴定弓形虫MIC6羧基端和醛缩酶的相互作用及两种蛋白在虫体内的定位。方法分别用GST-MIC6C多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀实验,实验产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。弓形虫速殖子涂片,... 目的鉴定弓形虫MIC6羧基端和醛缩酶的相互作用及两种蛋白在虫体内的定位。方法分别用GST-MIC6C多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀实验,实验产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。弓形虫速殖子涂片,免疫荧光定位法确定两种蛋白在虫体内的定位。结果与对照相比,GST-MIC6C多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白条带可分别被相应的抗体识别。荧光显微镜下显示,MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)两种蛋白皆定位于弓形虫的顶端。结论弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶存在相互作用并在虫体内存在共定位关系。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6羧基端 醛缩酶 免疫共沉淀 共定位
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弓形虫微线体蛋白研究新进展 被引量:4
9
作者 任娣 袁子国 剡海阔 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第4期206-209,共4页
微线体蛋白(microneme protein,MIC)是由位于弓形虫前端的微线体(microneme)分泌产生的,具有识别、黏附与侵染宿主细胞的性质。近年来研究结果证明,弓形虫的多种微线体蛋白在侵染宿主的过程中发挥重要作用,并且可以作为抗弓形虫病的疫... 微线体蛋白(microneme protein,MIC)是由位于弓形虫前端的微线体(microneme)分泌产生的,具有识别、黏附与侵染宿主细胞的性质。近年来研究结果证明,弓形虫的多种微线体蛋白在侵染宿主的过程中发挥重要作用,并且可以作为抗弓形虫病的疫苗候选分子。作者对目前研究较多的弓形虫微线体蛋白进行综述,为弓形虫疫苗的研究提供理论依据。 展开更多
关键词 弓形虫 微线体蛋白 疫苗
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刚地弓形虫MIC2与醛缩酶作用位点的鉴定 被引量:1
10
作者 郑斌 尹志奎 +3 位作者 姚志军 张海珠 任红斌 詹希美 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期698-700,708,共4页
目的确定刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)与醛缩酶的作用位点。方法利用定点突变技术,将MIC2羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(W767)突变为丙氨酸(A)。PCR扩增MIC2CW/A突变体基因片段;构建MIC2CW/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-M... 目的确定刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)与醛缩酶的作用位点。方法利用定点突变技术,将MIC2羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(W767)突变为丙氨酸(A)。PCR扩增MIC2CW/A突变体基因片段;构建MIC2CW/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2CW/A突变体蛋白。分别以该蛋白和GST-MIC2C蛋白(对照蛋白)作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果获得了MIC2CW/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2CW/A突变体蛋白;GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带,而且可以被醛缩酶抗体识别,而GST-MIC2CW/A蛋白的pull-down产物中未见蛋白条带。结论将MIC2的W767突变为A后,MIC2失去与醛缩酶的作用,即MIC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸(W)。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白2 醛缩酶 点突变 GST pull—down
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刚地弓形虫微线体蛋白6和醛缩酶在虫体内的定位 被引量:1
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作者 尹志奎 郑斌 +4 位作者 姚志军 刘世国 任红斌 许兵红 张海珠 《新乡医学院学报》 CAS 2013年第2期86-89,共4页
目的观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位。方法聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C(GST-MIC2C)蛋白... 目的观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位。方法聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C(GST-MIC2C)蛋白,用该蛋白免疫新西兰兔,制备GST-MIC2C多克隆抗体。刚地弓形虫速殖子涂片,分别用一抗、荧光二抗温育,荧光显微镜下观察。结果成功获得GST-MIC2C多克隆抗体。荧光显微镜下显示MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)2种蛋白皆定位于弓形虫的顶端。结论刚地弓形虫MIC6与醛缩酶在虫体内存在共定位关系,为2种蛋白相互作用关系的确立提供了细胞定位学证据。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6 醛缩酶 定位
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弓形虫14-3-3信号转导蛋白基因序列测定 被引量:2
12
作者 王维 沈继龙 +2 位作者 汪学龙 王朝兰 蒋作君 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第3期16-18,共3页
目的 克隆与鉴定弓形虫 14- 3- 3(Toxo14- 3 - 3)信号转导蛋白基因 ,用于寻找弓形虫新的诊断和候选疫苗分子 ,并在寄生虫入侵宿主细胞中寻找分子干预环节。方法 设计合成引物 ,以弓形虫RH株速殖子RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,用PCR扩... 目的 克隆与鉴定弓形虫 14- 3- 3(Toxo14- 3 - 3)信号转导蛋白基因 ,用于寻找弓形虫新的诊断和候选疫苗分子 ,并在寄生虫入侵宿主细胞中寻找分子干预环节。方法 设计合成引物 ,以弓形虫RH株速殖子RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,用PCR扩增出弓形虫 14- 3 - 3蛋白编码基因序列 ,克隆入 pGEM -T载体 ,并用双酶切法、以质粒为模板PCR法和DNA测序进行鉴定。结果 Toxo14- 3 - 3具有一个长度为 798bp的完整开放阅读框 ,与GenBank收录 (编号为ABO12 775 )Toxo14- 3 - 3蛋白编码基因一致 ,2个碱基出现密码简并。结论 本实验获得了完全正确的Toxo14- 3 - 3蛋白基因克隆 。 展开更多
关键词 弓形虫 14-3-3蛋白 基因克隆 信号转导
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定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6与醛缩酶的作用位点 被引量:1
13
作者 郑斌 尹志奎 詹希美 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期221-224,共4页
目的利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6(MIC6)与醛缩酶的作用位点。方法根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(V... 目的利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6(MIC6)与醛缩酶的作用位点。方法根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(V)的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3);0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白,亲和层析法纯化表达产物。以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白,GST-MIC6C蛋白为对照蛋白,分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析实验产物。分别以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白为探针蛋白和对照蛋白,与弓形虫醛缩酶蛋白液进行GST沉降实验,SDS-PAGE分析实验产物。结果获得了MIC6C W/V突变体基因片段,构建了相应的原核表达载体,表达并纯化了GST-MIC6C W/V突变体蛋白。GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫速殖子裂解液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体特异识别;GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫醛缩酶蛋白液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带。结论色氨酸(W348)为MIC6与醛缩酶的作用位点。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白6 醛缩酶 定点突变技术 蛋白作用位点
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弓形虫微线体蛋白1部分基因原核表达重组质粒pWR450-1-MIC1的构建、鉴定及测序 被引量:1
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作者 杨慧龄 肖建华 +2 位作者 梁瑜 张愉快 刘传爱 《南华大学学报(医学版)》 2002年第2期111-114,共4页
目的 构建弓形虫ZS2分离株pWR45 0 - 1 -MIC1原核表达重组质粒 ,为进一步表达及免疫做准备。方法 用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位 ,自行设计引物 ,用聚合酶链反应(PCR)技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋... 目的 构建弓形虫ZS2分离株pWR45 0 - 1 -MIC1原核表达重组质粒 ,为进一步表达及免疫做准备。方法 用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位 ,自行设计引物 ,用聚合酶链反应(PCR)技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋白 1 (MIC1 )的基因片段 ,经酶切、连接、重组入pWR45 0 - 1原核表达载体 ,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定和测序。结果 从ZS2分离株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段 ,克隆成功pWR45 0 - 1 -MIC1重组质粒。测序表明MIC1这部分基因与RH株相应碱基序列完全一致 ,高度保守。为下一步表达及免疫奠定基础。 展开更多
关键词 弓形虫 微线体蛋白1 部分基因原核表达 重组质粒 pWR450-1-MIC1 构建 鉴定 测序 克隆
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刚地弓形虫菱形体蛋白的研究进展
15
作者 郑斌 詹希美 《国际医学寄生虫病杂志》 CAS 2007年第2期79-81,共3页
菱形体蛋白(rhomboid)为一类跨膜丝氨酸蛋白酶,在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区,并对其进行蛋白水解,使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚... 菱形体蛋白(rhomboid)为一类跨膜丝氨酸蛋白酶,在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区,并对其进行蛋白水解,使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚地弓形虫入侵宿主细胞非常重要。深入研究刚地弓形虫菱形体蛋白,将有助于理解生物体菱形体蛋白的功能及研制新的药物以防治弓形虫感染。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 菱形体蛋白 微线体蛋白
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弓形虫组蛋白H3.3编码基因的亚克隆及序列分析
16
作者 朱健生 汪学龙 +2 位作者 沈继龙 姚涌 江宝玲 《热带病与寄生虫学》 2003年第4期197-199,共3页
目的克隆弓形虫组蛋白H3.3(Tg H3.3)的编码基因,以研究其在弓形虫病免疫诊断及免疫预防上的作用。方法以弓形虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增弓形虫组蛋白H3.3基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和... 目的克隆弓形虫组蛋白H3.3(Tg H3.3)的编码基因,以研究其在弓形虫病免疫诊断及免疫预防上的作用。方法以弓形虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增弓形虫组蛋白H3.3基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出一条约411bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT-PCR扩增的大小相同条带,序列测定结果表明其具有411bp的开放阅读框。结论成功构建了弓形虫组蛋白H3.3重组pGEM-T克隆载体,并完成了序列测定,为进一步的研究提供了条件。 展开更多
关键词 弓形虫 组蛋白 H3.3编码基因 亚克隆 序列 pGEM-T载体
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刚地弓形虫14-3-3蛋白真核表达载体的构建与表达 被引量:6
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作者 孙敏 何深一 +4 位作者 赵广会 丛华 周怀瑜 赵群力 孟敏 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期438-441,共4页
目的构建并表达刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体。方法用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒... 目的构建并表达刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体。方法用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒pcDNA3.0/14-3-3,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人宫颈癌(HeLa)细胞,蛋白印迹(Western blotting)分析表达产物。结果根据14-3-3蛋白基因片段序列和氨基酸序列预测,该蛋白分子为酸性可溶性蛋白,主要以同源或异源二聚体存在,有5个氨基酸保守序列区。RT-PCR的扩增产物约为800 bp,构建的真核表达质粒pcDNA3.0/14-3-3插入片段经测序,片段长度为801 bp,与GenBank中刚地弓形虫14-3-3蛋白基因序列(登录号为AB012775.1)同源性为99%。Western blotting分析结果显示,在转染pcDNA3.0/14-3-3的细胞中,有14-3-3蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,且表达量显著高于转染空质粒和未转染的细胞。结论构建了真核表达载体pcDNA3.0/14-3-3,并能在真核细胞内表达。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 14-3-3蛋白 真核表达 生物信息学
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刚地弓形虫自噬相关蛋白3基因的克隆表达与多抗制备 被引量:2
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作者 华倩倩 李相志 +6 位作者 万玉静 陈弟 赵徐寒晖 蒋凯 胡昕 潘长旺 谭峰 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期432-436,共5页
目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)自噬相关蛋白3(Tg Atg3)基因,并制备能特异性识别该蛋白的多克隆抗体。方法以弓形虫RH株c DNA为模板,构建p ET28a-Tg Atg3重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli)Rosetta感受态细胞,经自诱导培... 目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)自噬相关蛋白3(Tg Atg3)基因,并制备能特异性识别该蛋白的多克隆抗体。方法以弓形虫RH株c DNA为模板,构建p ET28a-Tg Atg3重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli)Rosetta感受态细胞,经自诱导培养基诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定。以纯化的Tg Atg3蛋白作为抗原皮下多点注射免疫日本大耳白兔,125μg/(只·次),免疫4次后心脏取血,制备血清,获得特异性抗Tg Atg3多克隆抗体。对制备的多克隆抗体进行Western blotting与间接免疫荧光法(IFA)鉴定。结果双酶切、PCR扩增及测序结果证实目的片段序列正确,原核表达质粒p ET28a-Tg Atg3构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组E.coli中可见相对分子质量(Mr)约44 000的可溶性Tg Atg3蛋白的高效表达。抗体检测Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的Tg Atg3蛋白。IFA结果显示,该多克隆抗体可与虫体胞浆内Tg Atg3结合。结论获得重组可溶性Tg Atg3蛋白,制备的多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的天然Atg3蛋白。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 自噬相关蛋白3 克隆 表达 多克隆抗体
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弓形虫微线体蛋白6,7,8与宿主Spata3,Dkk2蛋白相互作用的研究 被引量:1
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作者 刘卿 李法财 +3 位作者 杨文彬 刘国华 赵权 朱兴全 《经济动物学报》 CAS 2017年第2期68-74,共7页
为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分... 为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分别构建pGADT7-MIC6、pGADT7-MIC7和pGADT7-MIC8捕获载体及pGBKT7-Spata3和pGBKT-Dkk2诱饵载体。利用Clon Tech公司的MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid系统,将诱饵载体分别转化Y2HGold酵母菌,将捕获载体分别转化Y187酵母菌,最后通过酵母点对点验证分析弓形虫MIC6、MIC7和MIC8蛋白是否与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。结果表明:在酵母双杂交系统里MIC7和MIC8蛋白分别能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作,而MIC6不能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。 展开更多
关键词 弓形虫 微线体蛋白 蛋白互作 Spata3 Dkk2
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弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究 被引量:7
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作者 张燕丽 曹丽艳 +5 位作者 芦赟 蔡志杰 王艳华 付宝权 李文卉 张德林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1299-1302,共4页
根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴... 根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间。结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长。表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白3(mic3) 核酸疫苗 免疫保护
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