利用MigR1质粒构建CD19-CAR逆转录病毒载体优化其对人原代T细胞的转染效率

目的优化二代CD19嵌合抗原受体（CD19-CAR）逆转录病毒载体对人原代T细胞的转染效率。方法应用重组DNA技术将CD19．CAR构建人逆转录病毒载体，转入plat-A包装细胞收集病毒上清并转染人原代T细胞及K562细胞系，采用流式细胞术检测不同条件下的转染效率，用RT-PCR方法检测目的基因的表达情况，用ELISA法检测IFN-γ、TNF-α表达水平。结果①MigR1-CD19-CAR逆转录病毒载体成功构建后包装高滴度逆转率病毒；②相同条件下，MigR1-CD19-CAR逆转录病毒对K562细胞系转染效率显著高于T细胞；③对T细胞，离心120min组的转染率为（54．5±14．6）％，明显高于未离心组、离心30min组及离心60min组（P值均〈0．05）；④CD3／CD28磁珠与rhIL-2联合对人T细胞活化扩增效率个体差异显著，根据扩增倍数优化个体转染时机可提高转染效率（最高达69．3％），且RT-PCR检测证实CD19．CAR目的基因在转染后72hT细胞中高效特异性转录；⑤CD19-CAR-T细胞与CD19．K562细胞共培养组IFN-γ、TNF-α表达水平均增加，分别为（13230±1543）pg／ml、（4217±211）pg／ml，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。结论通过MigR1-CD19-CAR逆转录病毒载体转染人原代T细胞，并通过延长离心转染时间、根据扩增倍数确定个体转染时机而成功优化转染效率，RT-PCR检测CD19-CAR目的基因在转染后人T细胞中高效特异性转录，CD19-CAR-T细胞特异性识别靶细胞引发IFN-γ、TNF-α表达水平增加。

小鼠Aire逆转录病毒表达载体的构建及表达

目的:将小鼠Aire基因定向连入MigR1-GFP质粒,得到长期稳定的Aire逆转录病毒表达载体,收集逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞,为研究Aire在胸腺细胞终末分化中的作用奠定基础。方法:以小鼠胸腺基质细胞的cDNA为模板扩增得到Aire的ORF片段;将该片段连接入MigR1-GFP质粒;将构建成功的Aire-MigR1-GFP质粒转染293T细胞,收集逆转录病毒上清;使用逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞系MTEC9,流式细胞仪检测感染效率,Western blot确定Aire蛋白的表达。结果:(1)成功得到Aire的ORF片段。(2)构建的Aire逆转录病毒表达质粒能够成功表达Aire蛋白。(3)逆转录病毒上清成功感染胸腺基质细胞系MTEC9。结论:成功构建了小鼠Aire逆转录病毒表达载体,并实现了Aire蛋白在胸腺基质细胞系中的强制性表达。