Mineirao柱花草MSRA基因的克隆及其植物表达载体的构建

根据抗病柱花草中的1个AFLP特异片段SG2950-1设计引物,利用RACE技术从Mineirao柱花草中克隆到一个MSRA基因;经测序比对,该序列与细胞色素氧化酶系基因有较高的相似性。构建了植物表达载体,通过冻融法将该载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,为进行该基因的功能分析奠定了基础。

木薯柱花草间种体系固氮机制和生产效益分析

柱花草是重要的间种植物,但其与木薯间种体系中的固氮机制尚不清楚。本研究采用柱花草与木薯间种体系,分析柱花草生长期的农艺性状和不同组织氮含量的动态变化规律,结果表明:柱花草氮同位素值平均1.87‰,茎平均1.03‰,叶平均2.41‰,不同组织氮同位素呈现不同的变化趋势。前期柱花草氮素来源于土壤无机氮,中期无机氮和固氮都有贡献,后期柱花草急速生长阶段,固氮菌数量虽然增加,但其贡献逐渐减低,柱花草氮素主要来源转向土壤无机氮。此外,木薯间种柱花草较木薯单种增产鲜薯21.21%;间种与木薯单种、柱花草单种相比分别增加收入1361.09元/亩、1159.21元/亩,柱花草与木薯间种体系可有效提高氮源利用率和经济效益。

柱花草SgMPK6互作蛋白的筛选与验证

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应在调节植物免疫中起关键作用。柱花草炭疽病是危害柱花草生产的严重病害,柱花草SgMPK6基因具有抗炭疽菌的功能。为探究响应胶孢炭疽菌侵染的柱花草SgMPK6下游互作蛋白,本研究采用酵母双杂交技术,以SgMPK6激酶结构域作为诱饵蛋白,筛选柱花草cDNA文库,共获得74个与SgMPK6激酶结构域潜在的互作蛋白,并通过酵母双杂交点对点试验,验证了候选互作蛋白SgbHLH32、SgbHLH33、SgbHLH44与SgMPK6激酶结构域间的互作关系。磷酸化位点预测显示,3个bHLH转录因子均具有MAPKs潜在的磷酸化位点。柱花草响应炭疽菌侵染的qRT-PCR分析表明,SgbHLH32、SgbHLH33、SgbHLH44转录因子均显著上调,预示互作蛋白可能作为SgMPK6的底物调控柱花草对炭疽病的抗性。本研究为进一步解析SgMPK6响应炭疽菌侵染的分子机制提供了试验依据。

柱花草SgPAL3基因启动子的克隆及上游转录因子的筛选

柱花草(Stylosanthes spp.)是热带地区广泛种植的重要草种,炭疽病是危害柱花草的严重病害,柱花草SgPAL3基因具有抗炭疽菌的功能。本研究对启动子区域-2 000~0 bp,-1 500~0 bp序列分别构建诱饵载体并检测自激活,结果表明500 ng·mL^(-1)金担子素(Aureobasidin A,AbA)可以抑制两种诱饵载体的自激活。利用Gateway技术构建了柱花草响应炭疽菌的酵母cDNA文库,其容量为1.20×107,插入片段主要分布在750~2 000 bp,重组率为100%;利用酵母单杂交技术,筛选与SgPAL3基因启动子互作的转录因子,并验证了3个转录因子(SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8)与SgPAL3启动子的互作关系;qRT-PCR分析表明,SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8均响应炭疽菌的侵染,说明它们可能调控柱花草对炭疽病的抗性。本研究为进一步解析SgPAL3响应炭疽菌侵染的转录调控机制奠定了基础。

柱花草耐高温优质乳酸菌的筛选及对其青贮发酵品质的改善效果

为明确柱花草(Stylosanthes guianensis)青贮饲料中乳酸菌的耐高温情况及其对柱花草青贮品质的影响,采用传统微生物培养、分离、筛选结合16s rRNA基因鉴定技术研究了柱花草青贮饲料中的主要耐高温优质乳酸菌种类与生理生化特性,并用筛选出的优质乳酸菌菌株接种柱花草调制青贮饲料。结果表明:从柱花草青贮饲料中筛选出了7株可耐受45℃高温、7.5%NaCl盐度、pH 4.5酸度、至少可利用11种碳源、接种2 h后均能迅速产酸的优质乳酸菌;基因鉴定表明它们分属于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(S1、S2、S5和S6菌株)、人参土芽孢杆菌(Weizmannia ginsengisoli)(S3菌株)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(S4与S7菌株) 3个属。粪肠球菌S1菌株与戊糖片球菌S4菌株分别接种于柱花草青贮30 d后,不但显著减少青贮饲料的干物质损失(P <0.05),还使其pH、丁酸与氨态氮含量显著降低(P <0.05),乳酸含量显著高于植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)接种组(P <0.05),且肠杆菌科数量减少,无霉菌和酵母菌检出;特别是粪肠球菌S1接种组的粗蛋白含量显著高于植物乳杆菌接种组(P <0.05),可有效提高柱花草青贮饲料发酵品质并且保存更多的营养成分。

蔗糖对柱花草根尖类边缘细胞形成及耐铝功能的影响

【目的】根尖边缘细胞在植物对生物与非生物胁迫适应中起重要作用,但其形成的生理机制仍需进一步探究。本研究旨在探究蔗糖对柱花草Stylosanthes guianensis根尖类边缘细胞的形成及其铝毒耐受能力的影响。【方法】以圭亚那柱花草‘热研2号’为试验材料,采用外源添加糖源的方法,分析柱花草根尖类边缘细胞的形态特征,研究蔗糖对柱花草幼苗耐铝能力的影响。【结果】蔗糖和葡萄糖均能明显促进柱花草根尖类边缘细胞的形成。添加蔗糖处理的根尖类边缘细胞鲜质量、长度和宽度与无糖处理相比分别增加50%、14%和62%,细胞层数增加3~4层。保留根尖类边缘细胞的柱花草具有较强的耐铝能力;与无糖处理相比,蔗糖处理后形成的根尖类边缘细胞具有更强的吸铝能力,根尖铝累积明显减少,根系相对生长速率增加45%。【结论】蔗糖可以促进柱花草根尖类边缘细胞的形成,增强铝处理下根尖类边缘细胞对柱花草的保护作用。本研究结果为进一步探究柱花草根尖类边缘细胞发育及其适应铝毒胁迫的机制提供了理论依据。

荔枝园间作柱花草对土壤理化性质和土壤细菌群落结构的影响

探究荔枝园间作柱花草对土壤理化性质和土壤细菌群落结构的影响,为荔枝园间作柱花草提供理论依据。以荔枝园间作柱花草和荔枝单作2种模式的土壤样品进行土壤理化性质的测定,并进行细菌扩增子16S测序分析。结果显示:在荔枝园间作柱花草后,0~20 cm土层中,硝态氮含量显著提高47.52%,有效磷含量极显著提高141.53%,速效钾含量极显著降低125.59%;20~40 cm的土层深度,硝态氮含量极显著提高76.02%,有效磷含量显著提高48.52%,速效钾含量极显著降低188.57%。Alpha细菌多样性方面,在荔枝园间作柱花草后,0~20 cm土层和20~40 cm土层中,Chao1指数、AEC指数、Simpson指数和Shannon指数并无显著变化。在土壤细菌群落结构方面,土壤样品中主要的优势菌门均为Acidobacteriota、Proteobacteria、Firmicutes、Chloroflexi、Bacteroidota、Verrucomicrobiota、Actinobacteriota、Gemmatimonadota、Myxococcota,Crenarchaeota为0~20 cm土层深度下间作柱花草后土壤特有相对丰度大于1%菌门,Proteobacteria、Verrucomicrobiota、Gemmatimonadota的相对丰度在间作柱花草后的各土层深度均有提高;在属水平上,在0~20 cm土层,Candidatus_Nitrosotalea为间作柱花草后土壤特有相对丰度大于1%菌属,在0~40 cm土层,Nitrospira为间作柱花草后土壤特有相对丰度大于1%菌属;冗余分析结果表明,土壤细菌群落主要受有效磷、硝态氮和有机质的影响。综上所述,荔枝园间作柱花草会改善荔枝园土壤的理化性质和改变土壤细菌群落结构,对荔枝园土壤的环境条件起到一定的优化作用。

光果柱花草转基因毛状根及其原生质体制备体系的建立

光果柱花草(Stylosanthes leiocarpa)是柱花草属(Stylosanthes Sw.)中可用于林果园间作的一个野生种。截至目前,光果柱花草的转基因体系尚未建立。本研究以光果柱花草的子叶节为外植体,比较不同的发根农杆菌菌株与潮霉素B浓度对毛状根诱导率及转基因阳性率的影响。结果发现,以K599为诱导菌株且培养基添加8 mg·L^(-1)潮霉素B为筛选压,是最优的毛状根诱导条件,诱导率达23.33%,阳性率为100%。在此基础上,利用转基因毛状根制备原生质体,结果表明,添加2.5%纤维素酶和2%离析酶,以及8 h的酶解时间为最优条件,原生质体的产量达2.745×10^(5)个·g^(-1),活力为91.02%,制备的原生质体100%为转基因细胞。本研究成功建立了一种发根农杆菌介导的光果柱花草转基因毛状根诱导体系及原生质体制备体系,为后续光果柱花草的基因功能研究奠定了基础。

柱花草SgALMT1基因克隆与表达分析

为探索铝激活苹果酸转运蛋白(Aluminum-activated malate transporter,ALMT)在植物适应酸性土壤铝毒害中的重要作用,本研究以柱花草(Stylosanthes guianensis)为研究材料,克隆了柱花草SgALMT1基因,并进行了生物信息学、亚细胞定位及基因表达分析。结果表明:SgALMT1基因全长为1350 bp,编码450个氨基酸残基,蛋白分子量为50.6 kDa,包含6个跨膜结构域;亚细胞定位分析表明,SgALMT1蛋白定位在拟南芥原生质体细胞膜上,为膜蛋白。定量PCR结果表明,SgALMT1基因在柱花草叶中的表达量高于根中的表达量;铝处理增强了SgALMT1基因在柱花草根中的表达,表明SgALMT1基因可能参与了柱花草应对铝胁迫;另外,缺氮处理增强了SgALMT1基因在柱花草叶中的表达,而缺磷处理增强了SgALMT1在根中的表达。本研究结果为解析柱花草响应铝毒害和养分缺乏的机理提供了候选基因资源。

含水量对柱花草青贮品质和微生物群落动态的影响

本试验旨在探究含水量对‘热研2号’柱花草(Stylosanthes guaianensis SW.‘Reyan No.2’)青贮品质及微生物群落动态影响。试验设鲜贮组(F组)和萎蔫组(S组),测定柱花草青贮饲料的动态发酵品质和营养成分,并在青贮14 d和60 d测定细菌群落。结果表明:S组粗蛋白和乙酸含量显著高于F组,丁酸含量显著低于F组(P<0.05)。青贮14 d和60 d后,S组青贮饲料梭菌属(Clostridium)丰度显著低于F组(P<0.05)。微生物群落(属水平)与发酵指标关联性分析发现柱花草青贮发酵14 d,F组肠杆菌属(Enterobacter)与水溶性碳水化合物含量呈显著负相关,S组肠杆菌属与氨态氮含量呈显著正相关,与CP含量呈显著负相关(P<0.05);发酵60 d后,S组肠杆菌属与WSC含量呈显著负相关(P<0.05)。综合来看,降低青贮前柱花草的含水量更有利于柱花草青贮饲料营养成分的保存和提高柱花草青贮饲料发酵品质。

黄梁木叶精油对柱花草和水稻秸秆发酵品质及细菌群落的影响

为探究黄梁木(Neolamarckia cadamba)叶精油分别对柱花草(Stylosanthes guianensis L.)和水稻(Oryza sativa L.)秸秆青贮发酵品质和细菌群落结构的影响,本试验基于新鲜柱花草和水稻秸秆重量的0.5%和1%添加黄梁木叶精油(NCEO)进行青贮混合处理,每个处理3组重复,装入聚乙烯密封袋并用真空封口机密封,青贮30 d后测定样品的青贮发酵品质指标,分析细菌群落结构。结果表明:添加黄梁木叶精油显著降低了柱花草和水稻秸秆青贮饲料中pH值、氨态氮含量、乳酸菌和大肠菌群数量(P<0.05),显著提高了水稻秸秆青贮饲料的乳酸和真蛋白含量(P<0.05)。乳酸菌在水稻秸秆青贮饲料中占优势地位,且数量随黄梁木叶精油添加量的增加而升高。黄梁木叶精油的添加也增加了异根瘤菌属、甲基杆菌属和黄单胞杆菌属的相对丰度。综上所述,添加1%黄梁木叶精油可有效改善柱花草和水稻秸秆青贮发酵品质。

热研2号柱花草和热研4号王草混合青贮对其营养成分及发酵品质的影响

为合理开发和利用热带牧草资源,研究热研2号柱花草和热研4号王草混合青贮对其营养成分及发酵品质的影响,以期筛选出适宜的混合青贮比例,为调制高品质的青贮饲料提供理论依据。本研究将热研4号王草和热研2号柱花草混合青贮比例分别设置为100∶0(CK)、85∶15(A_(1))、70∶30(A_(2))、55∶45(A_(3))4组,青贮30 d后开封取样检测。结果表明:A_(2)组混合青贮感官评价最佳,随着热研2号柱花草比例的升高,pH和氨态氮/总氮(NH_(3)-N/TN)值逐渐升高,A_(1)、A_(2)、A_(3)组与CK组差异显著(P<0.05);乳酸(LA)含量逐渐降低,A_(3)组显著低于CK组(P<0.05);各试验组乳酸/乙酸(LA/AA)值均大于2.6;且A_(2)组丁酸(BA)显著低于其他各处理组(P<0.05)。随着热研2号柱花草比例升高,各处理组粗蛋白(CP)、干物质(DM)和粗脂肪(EE)含量随之升高,且显著高于CK组(P<0.05);水溶性碳水化合物(WSC)含量呈上升趋势,且各试验组差异不显著(P>0.05);中性洗涤纤维(NDF)逐渐降低,且各处理组间差异不显著(P>0.05);各试验组酸性洗涤纤维(ADF)显著降低(P<0.05);与CK相比,各处理组粗灰分(Ash)有所下降,且A_(1)、A_(2)、A_(3)组之间差异不显著(P>0.05);总之,热研2号柱花草和热研4号王草混合青贮可提高青贮饲料的发酵品质和营养价值。从发酵品质和营养价值综合考虑,A_(2)组的混合青贮比例最为适宜。

柱花草根系分泌物对缺磷胁迫的响应分析

为探索柱花草(Stylosanthes guianensis)根系分泌物对缺磷胁迫的响应,本研究以‘热研5号’柱花草为材料,通过水培试验,分析了正常供磷(+P)和缺磷(-P)处理对柱花草生长及根系分泌物的影响。结果表明,相对于+P处理,-P处理显著降低了柱花草植株干重和全磷含量。随后,代谢组共检测到101个根系分泌代谢物,可被分为有机酸、氨基酸、类黄酮、糖及醇类等七类,其中-P与+P处理间的差异累积代谢物25个。属于有机酸的咖啡酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸在-P处理下的分泌量显著增加,且其中α-酮戊二酸对磷酸铝具有较强的溶解能力。此外,荧光定量PCR分析发现,柱花草根系中参与α-酮戊二酸合成的柠檬酸脱氢酶基因SgICDH在-P处理下的表达量显著增加。因此,柱花草根系通过上调SgICDH基因的表达,促进α-酮戊二酸的合成与分泌,从而增强对难溶性磷的活化利用,以适应缺磷胁迫。

发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立

细茎柱花草(Stylosanthes gracilis)是圭亚那柱花草(S.guianensis)的野生近缘种,具有茎秆直立、种子落粒性低、抗旱能力较强等特点。为开发一种高效的细茎柱花草毛状根转化体系,本研究以细茎柱花草子叶节为外植体及4个发根农杆菌为供试菌种,探索菌液浓度、侵染时间、共培养时间对毛状根转化效率的影响。结果表明MSU440为诱导毛状根发生的最优菌株,诱导率为88.3%。其中,该菌株诱导毛状根产生的最佳条件为菌液浓度OD600=0.3、侵染时间为15 min、共培养4 d,转化效率达34.72%。同时,获得的转基因材料通过聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分子鉴定方式,证实了外源基因已整合到细茎柱花草毛状根的基因组中。因此,本研究成功建立了一种细茎柱花草的毛状根转基因体系。

柱花草响应炭疽菌侵染的差异磷酸化蛋白质组学分析

磷酸化是重要的蛋白翻译后修饰,在调节植物免疫方面起重要作用,但目前对柱花草与炭疽菌互作的磷酸化知之甚少。本文以太空诱变柱花草抗病株系‘2001-84’和感病株系‘2001-71’为试验材料,通过非标记定量磷酸化蛋白质组学,分析了两种株系接种炭疽菌前后的差异磷酸化蛋白。结果表明:在‘2001-84’和‘2001-71’中分别有138个和106个蛋白的磷酸化丰度特异性响应炭疽菌侵染。蛋白功能与代谢通路富集分析发现两者具有明显的差异:‘2001-84’特异性磷酸化蛋白主要定位在质膜附近,参与胞内信号传导,并显著富集在MAPK级联信号通路、植物激素信号传导、病原菌互作途径等代谢通路;‘2001-71’则更多的定位于细胞器膜上,参与细胞器的分解,代谢通路只在剪接体途径显著富集。通过对‘2001-84’特异性磷酸化蛋白进一步分析,发掘了跟抗病相关的蛋白。本文研究可为后续解析柱花草抗炭疽病的分子机制和培育柱花草抗病品种提供参考。

柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^(-1)甘露醇和4 mmol·L^(-1)MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10^(6))个·g^(-1)和92.271%;原生质体浓度为(6×10^(5))个·mL^(-1)、质粒浓度为0.6μg·μL^(-1),PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表达体系可应用于目标基因的瞬时表达和亚细胞定位研究。

三种外源物质对低温胁迫下柱花草生理与荧光特性的影响

为研究不同浓度脱落酸、壳聚糖和水杨酸喷施对低温胁迫下柱花草叶片生理指标和叶绿素荧光特性的影响,以播种50 d的幼苗为试验材料,叶面喷施法处理后,于光照培养箱中连续进行7 d低温(昼夜温8℃/5℃),2 d常温(昼夜温28℃/25℃)处理。结果表明,不同浓度外源物质喷施使低温下柱花草叶片光合色素含量、抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量显著增加;寒害指数、相对电导率、丙二醛含量显著降低,继续2 d常温处理后,各项指标有所回升。经300 mg·L^(-1)壳聚糖、0.4 mmol·L^(-1)水杨酸和10 mg·L^(-1)脱落酸处理的植株,叶绿素荧光参数的最大光化学效率(Fv/Fm)、电子传递量子产额(φE0)、性能参数(PIABS)分别显著升高了80.88%~122.57%、119.87%~170.53%和271.77%~580.49%;用于热耗散量子比率(φD0)显著降低了26.39%~37.10%。经隶属函数法综合评价,壳聚糖、脱落酸、水杨酸提高柱花草低温耐受性的最佳诱导浓度分别为:300 mg·L^(-1),10 mg·L^(-1),0.4 mmol·L^(-1)。在3种外源物质中,300 mg·L^(-1)壳聚糖处理可显著提高叶绿素含量和光系统Ⅱ(PSⅡ)的活性,减少热耗散,对缓解低温胁迫对柱花草的伤害效果最为显著。

高产抗病柱花草新品种选育 II高产抗病柱花草品种比较

于 1998 - 2 0 0 0年选择 12个柱花草Stylosanthesguianensis新种质进行品种比较 ,结果表明 :Mineirao柱花草、GC15 81柱花草年干草产量分别为 116 5 0 0kg/hm2 和 114 2 0 0kg/hm2 ,高于热研 5号柱花草 (9831 1kg/hm2 ) 18 5 0 %和 16 16 % ;抗旱性强 ,在冬春低温干旱季节的干质量占年产量的 2 9 2 5 %和 2 9 15 % ;较抗柱花草炭疽病 ,试验期内平均病级分别为 1 6 7,1 74 ;植株越冬存活率分别为 30 83%和 4 1 6 8% ,耐寒性强 ;茎叶比为 1 0 3和 1 0 7,营养价值丰富 ,营养生长期粗蛋白含量分别为 15 36 2 %和 11 5 5 0 % ,是优良的柱花草新品种。

海南半干旱地区芒果间作柱花草及作物效益初探(英文)

1998～2001年在海南东方干旱半干旱燥红土芒果与柱花草及作物间作示范区的实践表明,在芒果园间作扁豆、柱花草、番薯和花生可显著提高芒果挂果率,芒果收入比芒果单种分别增加97.79%、98.53%、54.41%和48.28%,果园综合收入比芒果单种分别增加108.55%、98.53%、97.98%和91.58%,同时,果园间作可显著提高果园土壤有机质、全氮、速效磷的含量和土壤pH值,间作扁豆使土壤有机质含量增加53.3%,间作柱花草使土壤全氮增加43.92%,速效磷增加78.16%,从而达到了以短养长、增加农民收入、提高土壤肥力和持续管理利用的目的。

铝胁迫诱导柱花草根系分泌柠檬酸

【目的】为揭示柱花草的耐铝机制,对铝诱导根系分泌柠檬酸进行了研究。【方法】采用水培方法,研究柱花草的耐铝性及铝对柱花草分泌柠檬酸的影响,并与紫花苜蓿进行对比。【结果】10μmol·L-1AlCl3对柱花草幼根生长的抑制不显著,而3和5μmol·L-1AlCl3处理24h后,紫花苜蓿幼根伸长明显受阻、根尖的铬天青着色明显。铝胁迫下柱花草根系分泌柠檬酸,且与铝浓度(10、20、30μmol·L-1AlCl3)和处理时间(6、12、18、24h)呈正相关,而紫花苜蓿根系无明显分泌。10μmol·L-1阴离子通道抑制剂(苯甲酰甲醛、尼氟灭酸、4,4-二异硫氰2,2-二磺酸、蒽9羧酸)显著抑制铝诱导的柱花草根系分泌柠檬酸。然而,铝处理对柱花草根尖柠檬酸合酶活性的影响不显著,蒽9羧酸处理也不改变该酶活性。【结论】根系分泌柠檬酸是柱花草抵御铝毒害的可能机制,而阴离子通道介导此分泌过程。