microRNA125对无义突变的人凝血因子Ⅸ基因调控的分子机制

目的构建人凝血因子Ⅸ小基因（Mini．hF9）及无义突变体，检测其mRNA表达水平，分析microRNA125对无义突变的F9基因表达调控的分子机制。方法利用PCR定点突变技术构建若干无义突变的人Mini—hF9并转染哺乳动物细胞HEK293T等，同时转染miR－125模拟物，通过实时荧光定量PCR（q—PCR）检测Mini—hF9基因mRNA表达水平。结果成功构建了Mini—hF9并在细胞中正确剪接。成功构建了无义突变体M1（nt34G〉TinExon7）、M2（nt52G〉TinExon7）和M3（nt85G〉TinExon7）。M1和M2突变体中Mini．hF9基因mRNA表达水平分别为野生型的14．1％（t=-15．464，P=0．004）和22．4％（t=-15．755，P=0．004），通过放线菌酮处理实验证实这是由于无义介导的mRNA降解（nonsense—mediatedmRNAdecay,NMD）所致。分别转染miR-125a模拟物和miR-125b模拟物后，M1突变体中Mini-hF9基因mRNA水平分别升高到1．70倍（t=-4．883，P=-0．039）和2．40倍（t=-17．537，P=0．003），M2突变体Mini—hF9mRNA水平分别升高到2．02倍（t=-19．264，P=0．003）和2．07倍（t=-9．158，P=0．012）。结论无义突变发生的位置是触发NMD途径的一个关键因素；microRNA125能够通过抑制NMD途径提高无义突变的凝血因子Ⅸ的mRNA水平。