应用Minigene剪接变异体分析技术诊断PMM2基因非经典剪接位点新变异的致病性

目的:研究Minigene剪接变异体分析技术在诊断磷酸甘露糖变位酶2(PMM2)相关先天性糖基化障碍(PMM2-CDG)中的价值,探讨磷酸甘露糖变位酶2(PMM2)基因剪接位点新变异对其转录产物的影响。方法:通过对1例PMM2-CDG患儿进行高通量测序查找可能的遗传学病因,利用Minigene剪接变异体分析技术,研究PMM2基因新剪接位点变异的致病性。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南,判断新变异的致病性。结果:遗传学分析发现患儿系PMM2基因母源性c.691G>A(p.Val231Met)变异和父源性c.447+5G>A变异复合杂合子。Minigene剪接变异体分析发现:变异c.447+5G>A导致PMM2基因转录产物形成r.348_447del转录本,为致病性PMM2基因变异。患儿的临床特征为皮肤巩膜黄染,血清总胆红素、非结合胆红素和总胆汁酸明显升高,白蛋白明显降低,甲胎蛋白、铁蛋白和促甲状腺素等升高,对症支持治疗效果欠佳。结论:Minigene剪接变异体分析可为PMM2-CDG确诊和家系遗传咨询提供新的分子标记物,扩展了PMM2基因变异谱,为该病的临床诊治提供新的参考依据。

心肌病相关基因剪接变异预测软件的评估与临床应用

目的:发生在非经典剪接区域的基因突变是遗传性心肌病的重要致病因素。目前研究者已经开发了多种软件来预测变异对可变剪接的影响。然而,这些预测软件在遗传性心肌病基因诊断中的应用尚不明确。因此,本研究拟评估相关软件的预测性能,并探讨这些预测软件在肥厚型心肌病(HCM)患者中的临床应用。方法:对1 212名散发性肥厚型心肌病患者进行全外显子组测序(WES),并从公开发表研究中收集引起HCM相关基因可变剪接的突变位点。基于剪接区域特异性的策略来评估剪接变异预测软件的性能,找到针对各个区域的最优预测软件来筛选候选剪接变异,最后在体外HEK293细胞中通过Minigene实验来验证这些变异的剪接结果。结果:性能评估表明,各个剪接区域的最佳预测软件分别是Pangolin(深外显子、核心供体和扩展供体区)、MLCsplice(扩展供体、核心受体和扩展受体区)、MMSplice和SpliceAI(扩展供体区)。本研究在4.5%(54/1 212)的散发性肥厚型心肌病病例中预测得到43个“优先变异”,其中有23个变异经实验证实会导致异常剪接。结论:基于剪接区域特异性预测方法可以有效识别剪接变异,从而提高遗传性心肌病基因检测的诊断率。

牛白介素32基因可变剪接体（1L-32γ）的分子克隆及功能验证

牛白细胞介素32（interleukin-32，IL-32）基因是近年发现的一种新型功能基因，是一种炎症性细胞因子，其主要作用是诱导其他细胞因子和化学因子的产生，并在自身免疫性炎症性疾病中发挥重要作用，可促进细胞凋亡，从而抑制结核分支杆菌，

人SLC25A13基因内含子突变IVS6-11A>G导致转录子剪接异常

目的:通过minigene剪接实验分析SLC25A13基因内含子突变IVS6-11A> G是否导致转录子剪接异常,并确定其剪接方式,进而明确其在Citrin缺陷病的致病性.方法:构建携带突变的目的片段外显子捕获载体,转染293T细胞后逆转录PCR扩增转录产物,测序并分析.结果:IVS6-11A> G突变导致SLC25A13基因内含子6的3'端10个碱基保留于转录子中,致蛋白翻译提前终止,Citrin蛋白功能丧失.结论:SLC25A13基因IVS6-11A> G突变为剪接突变,其剪接方式为可变3'剪接,该突变为Citrin缺陷病致病突变.

基于结合HM-SVM方法的HMM剪接位点识别研究

为了对剪接位点取得更加精确的预测结果,采用HMM方法设计并构建了剪接位点识别系统。该系统利用HM-SVM工作集最优化算法训练并优化HMM模型,依据剪接位点附近存在的序列保守性,高效地提取位点附近保守序列在边缘分布与条件分布上的统计特征。实验结果表明,该识别系统在用于剪接位点的识别中较常用的机器学习方法获得了更高的识别率。

CASQ2基因c.381C>T突变致儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速的分子机制

目的:对心电图上有U波,首诊怀疑长QTU综合征(LQTU)的两个家系进行基因筛查和功能检验,以期找到致病突变并结合临床信息作出疾病诊断。方法:筛查对象是2004~2005年来我院就诊的两个初诊为LQTU的家系L79和L104。诊断依据包括临床特征,如交感神经兴奋相关的晕厥,心电图记录到QT间期(或QU间期)延长及室性心动过速,且无器质性心脏病。记录先证者及其父母和一级亲属的病史、心电图和家族史,包括12导联静息心电图、24 h动态心电图和运动试验等。采用全外显子及Sanger测序法进行基因筛查。对发现的突变利用微小基因(minigene)技术进行功能验证。结果:两个家系中共有3例女性患者,皆为5岁左右首次发生晕厥。儿时心电图上有显著U波,随年龄增加U波幅度降低或消失。校正QT间期正常或临界值。基因筛查发现3例患者携带有CASQ2基因上的c.381C>T(p.Gly127=)纯合突变,父母杂合携带。其中L79家系先证者同时携带KCNQ1/c.921+1G>T杂合突变。Minigene实验证实,CASQ2/c.381C>T(p.Gly127=)突变虽未引起编码氨基酸改变,但其改变了3号外显子后面的生理性剪接位点并在380_381位点引入了一个新的剪切位点,致使其后41个核苷酸缺失,并在第128位置产生提前终止密码子。3例患者服用普萘洛尔或联合使用美西律,近3~15年无晕厥。结论:基因筛查及minigene功能验证结合家系临床表现,可确诊这3例患者为CASQ2/c.381C>T(p.Gly127=)纯合突变引起的儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(CPVT)2型,L79先证者同时伴有KCNQ1/c.921+1G>T杂合突变所致的长QT综合征1型。本研究在中国CPVT患者中发现CASQ2基因编码区内的核苷酸同义变异可导致剪接突变效应。

Leber先天性黑矇10型一家系CEP290基因变异及临床表型分析

目的确定并观察1个汉族Leber先天性黑矇(LCA)家系的致病基因变异和临床表型。方法回顾性研究。2022年5月在河南省立眼科医院就诊的LCA10型一家系(1例患者和2名家系成员)纳入研究。详细询问患者病史、家族史并行眼底彩色照相、闪光视网膜电图(F-ERG)检查。采集先证者及其父母的外周静脉血3 ml,提取全基因组DNA。全外显子组测序(WES)、线粒体环基因组(mtDNA)测序以获得致病基因及变异。通过生物信息学分析方法对所有变异位点进行注释,并参考美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)对所有变异位点进行致病等级评估。对候选位点进行Sanger验证,并对致病性证据不足的错义变异行Minigene体外功能验证。结果先证者,男,7个月。视物追随反应差,指压眼征、畏光、眼球震颤,黄斑中心凹周围区视网膜色素上皮部分脱失。2岁时,F-ERG检查发现,双眼a、b波振幅重度降低,峰时延长,甚至无波形。先证者父母临床表型未见明显异常。WES结果显示,先证者CEP290基因第40、2号外显子分别存在c.5515_5518del(p.Glu1839Lysfs*11)(V1)移码变异和c.74C>T(p.Ala25Val)(V2)错义变异。mtDNA测序结果为阴性。Sanger验证结果表明,先证者父亲、母亲分别携带杂合移码变异V1、新发错义变异V2,构成复合杂合变异。Minigene体外功能验证结果表明,V2变异使2号外显子产生一个新的剪接供体位点,从而导致2号外显子右侧缺失30个碱基对,蛋白质框内缺失10个氨基酸残基。ACMG评级分别为致病(V1)、可能致病变异(V2)。结论CEP290基因c.5515_5518del和新发变异c.74C>T构成复合杂合变异可能是本家系的致病原因,分别导致截短蛋白的产生和前体信使RNA的异常剪接。LCA具有发病年龄小、视功能严重损害和致病变异多样性等特点。

ABCC6基因变异所致婴儿泛发性动脉钙化1例患儿的遗传学分析

目的:探讨1例罕见的ABCC6基因变异所致婴儿泛发性动脉钙化(GACI)患儿的临床表现与遗传学病因。方法:选取2022年8月26日就诊于首都医科大学附属北京儿童医院保定医院的1例44 d女性患儿作为研究对象。收集患儿的临床资料,通过核心家系全外显子组测序(Trio-WES)、全基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)以及Minigene剪接实验对变异进行致病性分析。结果:患儿主要表现为发热、炎症指标高、抗感染治疗无效,超声显示全身大、中动脉广泛钙化、管壁增厚,考虑为GACI以及相关的动脉炎,经糖皮质激素、生物制剂治疗后发热缓解。Trio-WES发现患儿携带ABCC6基因复合杂合变异c.4404-1G>A与c.4041+5G>T,后者既往未见报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)相关指南,两个变异被分别判定为可能致病性(PVS1+PM2_Supporting)与临床意义不明(PM2_Supporting+PM3+PP3)。CNV-seq检测未见异常。Minigene剪接实验进一步验证两个变异均可影响剪接。结论:对于不明原因及常规治疗无效的发热,需要及时完善基因检测,避免GACI的漏诊。

全外显子测序技术在遗传性眼病诊断中的应用研究

目的评估全外显子组测序(WES)在遗传性眼病诊断中的应用。方法本研究收集2020年12月至2023年12月以先天性眼部疾病为主诉在复旦大学附属妇产科医院进行生殖遗传咨询的患者为研究对象,共24例。所有病例均已排除了已知感染或暴露于已知的致畸药物、核型和染色体微阵列分析(CMA)异常。采集先证者及其家系成员外周血样本,提取基因组DNA并进行WES检测,其中单人WES 3例,家系WES 21例,分析筛选出潜在致病位点并进行致病性分类及Sanger测序验证。针对RPGRIP1:c.1611+26G>A内含子变异构建minigene载体行逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测mRNA剪接影响。结果24个家系中20(83.3%)个获得了明确病因的阳性结果,共涉及21个基因,鉴定出30个不同变异,其中19个为新变异。家系3产前诊断分析结果显示胎儿PRPF8基因携带c.6970G>T杂合无义突变;家系24中非经典剪接位点minigene载体RT-PCR结果提示突变型质粒转录产物12号内含子部分保留104 bp,即p.Glu538Valfs*12。结论WES在遗传性眼病诊断中的高检出率进一步支持了其应用优势,可作为明确遗传性眼病病因的重要分子检测工具。