Mitf-M在羊驼皮肤组织的表达与序列分析及免疫组织化学定位

【目的】克隆羊驼皮肤组织表达的Mitf-M CDS序列,比较分析羊驼皮肤组织Mitf-M的特征,进一步定位分析Mitf-M蛋白表达的位置,为深入研究羊驼毛色基因表达机制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增方法分段扩增Mitf-M CDS区,分别利用Clustal X和BioEdit生物学软件对氨基酸序列进行多重序列比较分析,免疫组织化学技术对Mitf-M蛋白定位分析。【结果】羊驼皮肤组织表达的Mitf-M的CDS区由419个氨基酸组成,具有bHLH-zip转录家族的保守结构域,该基因与牛和犬亲缘关系最近,Mitf-M蛋白主要分布于羊驼皮肤组织毛球基底层细胞之间与毛乳头周围的黑色素细胞中。【结论】与其它物种相比较,羊驼皮肤组织表达的Mitf-M蛋白保守性很强,在进化过程中的变异不大,可见Mitf-M为毛发的色素沉积提供重要的物质基础。

牦牛MITF-M基因序列分析及其在皮肤组织中表达水平

研究牦牛MITF-M基因编码区序列及其编码蛋白的结构,以及其在皮肤组织中mRNA的表达水平,探讨MITF-M基因与牦牛毛色形成相关性,以期为揭示牦牛毛色形成分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术扩增,成功获得了牦牛MITF-M基因编码区序列。采用生物信息学方法,预测分析MITF-M基因及其编码蛋白的基本理化性质、二级结构等;采用半定量PCR检测技术,检测出MITF-M基因mRNA在牦牛各组织器官中表达水平;通过荧光定量PCR技术检测出在牦牛不同颜色皮肤组织中MITF-M基因mRNA表达水平。结果表明,扩增得到的MITF-M基因的编码区是一条长为1 460 bp的DNA序列。将牦牛的MITF-M基因序列命名为YAK MITF-M,并且在NCBI数据库中注册该基因的登录号为KM985448。牦牛MITF-M序列基因含有一个长度为1 242 bp的开放性阅读框,编码413个氨基酸,二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠和延伸链较少。MITF-M基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛MITF-M与黄牛、绵羊等物种的MITF-M氨基酸具有高度相似性。在牦牛各组织器官中,MITF-M基因mRNA仅在皮肤组织中特异性表达,且在不同毛色牦牛皮肤组织中,MITF-M在黑色被毛皮肤组织中mRNA表达量显著高于白色被毛皮肤组织(P<0.01)。

蓝狐MITF-M基因序列扩增及生物信息学分析

试验旨在研究蓝狐MITF-M基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。从成年蓝狐背部皮肤组织中采集1cm×1cm样品,采用RT-PCR扩增及测序技术首次获得MITF-M基因序列3 880bp(包括5′侧翼区2 262bp、CDS区1 260bp、3′侧翼区358bp),编码419个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示,蓝狐MITF-M基因5′侧翼区存在潜在的启动子区域(-86^-336bp),且发现TATA框、CAAT框、GC框和CRE等调控元件及CREB、LSF和Sp1等多种转录因子。MITFM基因编码的蛋白是定位于细胞核和细胞质的不稳定、可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位结果提示该蛋白在细胞核、细胞质和线粒体的概率较高,分别为65.2%、17.4%和8.7%。DNAMAN软件对MITF-M基因编码蛋白的二级结构预测发现,该蛋白由α螺旋(33.66%)、β折叠(16.66%)和无规卷曲(49.68%)组成,且不存在跨膜区域和信号肽。蓝狐与其他物种MITF-M基因编码的氨基酸序列同源性对比和系统进化树分析均提示蓝狐与犬的遗传亲缘关系最近,与哺乳动物和禽类均具有较高的同源性(>89.1%),说明MITF-M基因编码区在物种进化过程中较为保守。本研究为深入研究MITF-M基因调控狐狸被毛颜色的分子遗传机制奠定了理论基础。

猪MITF-M的转录调控分析

旨在研究猪MITF-M(microphthalmia associated transcription factor M)转录调控区域活性以及验证重要转录因子。以猪DNA为模板,利用PCR扩增获得MITF-M转录调控区,基因克隆得到5′端缺失重组载体,运用双荧光素酶报告基因试验进行转录活性分析,再通过干扰RNA试验验证重要转录因子。本试验成功克隆得到MITF-M 6 414bp的转录调控区域;构建了9个调控区5′端缺失重组载体;鉴定出MITF-M转录调控区内3个转录活性显著变化区域(P<0.001),分别是位于-1 140～-1 397和-5 429～-6 036bp的正调控区域、-2 470～-3 753bp的负调控区域;发现了转录因子KLF4显著负向调控MITF-M的转录活性(P<0.01)。结果提示,转录因子KLF4抑制MITF-M的转录活性,调控黑色素细胞色素的合成与沉积,从而影响猪毛色的表型。本试验为进一步研究猪MITF-M基因的表达机制奠定了基础,对深入研究猪毛色变化的表达调控机理具有重要意义。

SOX5影响小鼠皮肤黑色素细胞MITF-M表达和黑色素生成

旨在探讨SOX5在小鼠皮肤毛色中的作用。本研究随机选取出生后12d的C57BL/6品系黑色、棕色、灰色小鼠各3只,采用实时荧光定量PCR、Western blotting和免疫组织化学方法对SOX5在黑色、棕色和灰色小鼠皮肤中的表达差异进行分析;并构建SOX5真核表达载体;运用体外转染的方法,转染小鼠黑色素细胞并检测与色素形成相关基因的表达水平,同时测定黑色素含量。结果表明:1)SOX5在不同毛色小鼠皮肤中均有表达,SOX5在黑色和灰色小鼠皮肤中mRNA和蛋白相对表达量高于棕色小鼠皮肤,均差异极显著(P<0.01);且其主要表达部位为毛囊外根鞘。2)转染组与空载组相比,MITF-M、TYR、TYRP1、TYRP2、PMEL、OA1表达量均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高,黑色素含量也极显著增加(P<0.01)。3)过表达MITF-M对SOX5存在负反馈作用。综上表明,SOX5通过调控MITF-M影响色素的生成进而参与毛色的形成。

Mitf-m敲除小鼠的基因差异表达分析

目的使用RNA-Seq技术分析Miif-m敲除鼠与野生鼠的血管纹转录组，研究Mitf-m基因敲除后的差异表达基因及相关改变的分子机制。方法分别取Miif-m敲除鼠（Mitfmi-△M/mi-△M；MM组）与野生鼠（Miif-m＋/＋；ww组）的血管纹进行总RNA提取；制备cDNA文库，用Illumina HiSeq 2000测序系统行高通量测序。利用软件Tophat2．2．0将cleanreads比对到参考基因组；分别用软件RSeQS-2．3．2和cufflinks来检测测序结果的均一性和基因表达水平。使用edgeR和DESeq程序筛选差异表达基因（differential expressed genes，DEGs）；选择下调DEGs，用KOBAS2．O进行基因本体（geneontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代谢途径的富集分析。结果MM组与WW组在参考基因组上mapping的cleanreads数分别为42463888和39718542，分别有88．7％和87．4％的reads是唯一映射，说明RNA-Seq结果可靠。DEGs筛查结果表明，相对于WW组，Mftf-m敲除鼠血管纹有45个DEGs，上调表达基因有7个，下调表达基因有38个。GO富集分析发现下调表达基因与黑色素的合成和代谢过程、色素沉着有关，值得关注的是与内向整流钾离子通道Kcnj10和Kcnj13相关。KEGG富集分析显示下调表达基因主要富集于黑色素生成通路。结论RNA-Seq分析拓展了Mftf-m基因调控网，为探究Mitf-m突变所致听力-色素综合征的分子机制及特异性研究Mitf不同转录子的功能奠定了基础。

北极狐MITF-M基因启动子活性及转录调控元件的分析

为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。

豪猪MITF-M转录本测序及其生物信息学分析

为获得豪猪MITF-M转录本序列,并对其进行生物信息学分析,试验首先将人工饲养豪猪的耳廓皮肤组织样本提取总RNA后进行无参转录组测序,对获得的所有MITF转录本通过序列比对分析筛选豪猪MITF-M转录本序列,然后采用生物信息学在线软件对豪猪MITF-M基因编码蛋白的理化性质、氨基酸组成、亚细胞定位、二级结构、三级结构、信号肽和跨膜区域进行预测和分析,最后分析豪猪与大鼠、鸡、绵羊等9个物种MITF-M蛋白的同源性,并采用邻接法构建MITF-M蛋白的系统进化树。结果表明:获得豪猪MITF-M转录本序列(已上传至GenBank,登录号为MW84037),序列全长为4772 bp,含9个外显子,CDS长度为1260 bp(229~1488 bp),编码419个氨基酸。豪猪MITF-M蛋白化学分子式为C_(2010)H_(3263)N_(585)O_(652)S_(26),共由6536个原子组成;相对分子质量为46890.11;理论等电点为5.82,为酸性蛋白质;脂肪氨基酸系数为79.64,不稳定指数为69.40,亲水指数为-0.617。豪猪MITF-M蛋白共由20种氨基酸构成,其中亮氨酸含量最高(占比为11.5%),而色氨酸含量最低(占比为0.2%);带正电荷(天冬氨酸、谷氨酸)和负电荷(精氨酸、赖氨酸)的氨基酸残基数目分别为52个和44个;二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲构成,其中α-螺旋占比为37.47%,延伸链占比为7.40%,β-转角占比为2.86%,无规则卷曲占比为52.27%;三级结构中存在左右对称的CLEAR-box结构;豪猪MITF-M蛋白不具有信号肽,不存在跨膜区域;豪猪MITF-M蛋白的氨基酸序列与人MITF-M蛋白相似性最高,为95.7%;与猪MITF-M蛋白变异性最低,仅为4.2%。豪猪与同属啮齿目的大鼠、小鼠的进化距离较近,与物种分类相吻合。说明成功获得了豪猪MITF-M转录本序列,其编码蛋白符合转录因子在细胞核中发挥作用的结构特点。