常用哺乳动物精子质量检测方法

根据精子的特性 ,利用光学显微镜、荧光显微镜、流式细胞记数仪等仪器 ,结合常规染色技术或荧光探针技术 ,通过检测精子染色质的状态、运动能力、质膜的完整性、顶体的状态、线粒体的活性、获能、顶体反应以及与卵子的结合能力等指标来评价精子的功能状态 ,以便准确预测精子的受精能力。

哺乳动物精子质量检测原理及方法

人工授精和体外受精技术的不断发展,以及这些技术在生产实践中如各种濒危野生动物的拯救、哺乳动物繁育、人类不孕症的解决中的应用,使得精子质量评价方法也在不断改善。作者综述了精子的质膜完整性、顶体的状态、染色质状态、线粒体活性、精子DNA损伤检测以及受精能力等指标的检测原理及方法,以便准确预测精子的受精能力。

七氟烷后处理对大鼠离体心脏缺血／再灌注损伤心功能和线粒体的影响

目的探讨七氟烷后处理对大鼠离体心脏缺血/再灌注的保护作用。方法48只SD大鼠,随机分为4组(n=12):假手术组(Sham),缺血/再灌注组(I/R)缺血后处理组(Post),七氟烷后处理组(Sevo)。采用Langendroff离体心脏灌注模型。除Sham组其余各组均平衡灌注30min,全心缺血30min,再灌注90min,Post组在再灌注即刻给予4个循环复灌20s/缺血20s,Sevo组在再灌注开始给予含1.5MAC(2.57V/V)七氟烷的K-H液灌注5min,再用K-H液冲洗10min,纪录平衡灌注末,再灌注30min、60min、90min时左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左室内压上升最大速率(+dp/dt)、左室内压下降最大速率(-dp/dt)、心率(HR)、冠脉血流量(CF),再灌注90min时,计算心肌梗死面积百分比,电子显微镜观察线粒体的损伤程度,Westernblot半定量测定胞质和线粒体、细胞色素C的水平。结果平衡灌注末各组间心功能指标(基础值)差异未见统计学意义(P>0.05)。七氟烷后处理组和缺血后处理组可改善再灌注损伤心功能的各项指标(P<0.05)。复灌90min,Sevo组和Post组心肌梗死面积显著低于I/R组(P<0.05)。与I/R组比较,Sevo组和Post组胞质细胞色素C的含量明显减少(P<0.05),同时伴随线粒体细胞色素C的含量明显增多(P<0.05)。电子显微镜观察线粒体形态,Sevo组和Post组的损伤程度比I/R组明显减轻。结论七氟烷后处理对大鼠离体心脏再灌注损伤有明显的保护作用,其保护强度与缺血后处理相当,机制可能与减轻线粒体的损伤,抑制细胞色素C的释放有关系。

脱落酸对植物线粒体膜生物物理特性的影响

采用１，６－二苯基－１，３，５－已三乙烯（ＤＰＨ）荧光偏振法和中性红法分别研究了脱落酸（ＡＢＡ）对玉米黄化芽及大豆子叶离体线粒体膜的微粘度（η）、表面电位（ψ）等生物物理特性的影响。结果表明：ＡＢＡ有降低线粒体膜的微粘度及提高线粒体膜的表面电位作用，并导致呼吸速率升高，呼吸控制和氧化磷酸化偶联下降。ＡＢＡ对线粒体膜微粘度的作用具有浓度饱和效应；ＡＢＡ对线粒体膜表面电位的提高作用，因植物不同而有差异，对玉米的作用要大于对大豆的。追踪线粒体Ａ（３５０）值的变化，还证实，ＡＢＡ提高了大豆线粒体的Ａ（３５０）值，即导致大豆线粒体的相互聚集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）。

α-细辛醚调控GADD153和Smac mRNA表达诱导人食管癌细胞株Eca-109凋亡研究

目的α-细辛醚具有止咳、平喘、解痉、镇静、抗惊厥等功效,文中旨在探讨α-细辛醚对人食管癌细胞株Eca-109促凋亡作用,以及对生长抑制DNA损伤基因153(GADD153)和第2个线粒体来源的半胱氨酸酶的激活剂(Smac)表达的影响。方法体外培养人食管癌Eca-109细胞,以加入药物不同分为空白对照组、5-氟尿嘧啶组(5-FU,500μg/m L)和不同剂量的α-细辛醚(25、50、100μg/m L);继续培养后,采用MTT法检测细胞增殖率,Annexin V-PI法检测细胞凋亡率,Western blot和实时荧光定量PCR法分别检测GADD153、Smac蛋白及mRNA的相对表达量。结果 5-氟尿嘧啶组、α-细辛醚25μg/m L组、α-细辛醚50μg/m L组、α-细辛醚/100μg/m L组细胞凋亡率[(15.59±0.48)%、(4.61±1.13)%、(9.48±1.09)%、(12.41±0.98)%]较空白对照组[(0.29±0.08)%]明显升高(P<0.05),与空白对照组比较,α-细辛醚组细胞GADD153、Smac蛋白及GADD153、Smac mRNA相对表达量均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论α-细辛醚通过上调GADD153及Smac mRNA的表达,抑制人食管癌Eca-109细胞增殖,促进其凋亡,凋亡途径由内质网和线粒体通路共同介导。

肥大心肌细胞溶酶体对线粒体降解作用的细胞化学研究

用细胞化学胞嘧啶单核苷酸酶（ＣＭＰ酶）作为溶酶体标志物，来研究大鼠腹主动脉结扎造成心肌细胞肥大后溶酶体降解线粒体过程。研究结果表明在结扎后２０周线粒体主要降解方式是线粒体直体和溶酶接融合，然后线粒体逐渐降解，而线粒体的自噬小体形成是非常少见的。

热应激大鼠肝线粒体微粒体脂质过氧化与钙镁三磷酸腺苷酶的变化

为探讨高温对机体的损伤机理和防治措施，对热应激过程肝线粒体、微粒体脂质过氧化、钙镁三磷酸腺苷酶（Ｃａ－Ｍｇ－ＡＴＰａｓｅ）的变化与联系进行了观察。结果显示，受热大鼠肝线粒体、微粒体丙二醛（ＭＤＡ）含量明显增多，并随受热时间延长而升高；受热（４２℃）１２０ｍｉｎ后大量的肝细胞变性、坏死，超微结构改变明显。脱离热接触６ｈ，肝线粒体ＭＤＡ含量恢复到对照组水平，但微粒体ＭＤＡ明显升高。肝线粒体ＭＤＡ含量增多，Ｃａ－Ｍｇ－ＡＴＰａｓｅ活性下降；ＭＤＡ含量降至对照组水平时，Ｃａ－Ｍｇ－ＡＴＰａｓｅ活性恢复到对照组水平。提示，经一定时间热应激后脱离热环境后，肝线粒体脂质过氧化可恢复，而微粒体脂质过氧化不易恢复；热应激肝线粒体ＭＤＡ含量与Ｃａ－Ｍｇ－ＡＴＰａｓｅ活性变化存在一定联系。

线粒体DNA单倍群M与迟发型肝癌的关系

目的近来研究发现线粒体DNA(mtDNA)非编码区D-loop区单核苷酸多态性累积与多种肿瘤的发生有关,单核苷酸多态性与肿瘤的发生和预后的关系已经被详细阐述,本研究旨在探讨mtDNA D-loop区单核苷酸多态性与肝癌患者发病年龄的关系。方法河北医科大学第四医院完成50例肝癌患者外周静脉血mtDNA D-loop区测序,单核苷酸多态性与患者发病年龄的关系分析采用Kaplan-Meier法,组间比较采用log-rank检验。结果经log-rank检验证实多态性位点235G基因和单倍群489C与迟发型肝癌有关,差异有统计学意义(χ2=5.740,P=0.05;χ2=4.810,P<0.05)。结论 mtDNA D-loop区多态性位点可作为患肝癌患者发病年龄预测标记,同时mtDNA D-loop区多态性位点有助于识别早发的肝癌患者。

脑缺血后ET-1和SPM、Mit Na^+-K^+-ATP酶的变化

应用兔大脑中动脉阻断模型，分离出突触膜（synapticplasmamembrane，SPM），线粒体（mitochondria，Mit）并测其Na+－K+－ATP酶活性，同时以放免法测定脑组织内皮素－1（ET－1）含量。结果发现脑缺血后脑组织ET－1含量显著增加，SPM、MitNa+－K+－ATP酶活性下降，两者呈显著负相关（r1＝－0．9776，P＜0．05；r2＝－0．9980，P＜0．02）．提示ET－1在脑缺血脑水肿中的作用可能与其抑制Na+－K－－ATP酶活性有关。

放射性碘致大鼠甲状腺损伤超微结构的形态计量学研究

本文应用透射电镜观察了在较低剂量１３１Ｉ作用大鼠甲状腺滤泡上皮细胞超微结构的变化特点，分析了线粒体的变异发生率，并应四川大学研制的ＭＩＡＳ－３００图像分析系统和用形态计量学方法，测定了胞质内粗面内质网的二维和三维形态计量学参数。结果表明：所测的各项参数都有随剂量增高而增大的趋势，并呈现较好的效应剂量依赖关系。由此计算的Ｄ２５值和Ｄ５０值，以粗面内质网体积密度的变化最为明显。提示，低剂量１３１Ｉ作用于滤泡上皮细胞，其早期应重视内质网的损伤效应。

自然衰老大鼠脑线粒体和血小板膜外周型苯二氮 受体结合活性的变化

目的以3月龄青年大鼠为对照,观察24月龄自然衰老大鼠大脑皮层线粒体和血小板膜外周型苯二氮受体(PBRs)结合数量及亲和力的改变。方法雄性SD大鼠断头取脑,以差速离心法提取大脑皮层线粒体,低渗溶血法制备外周血小板膜。采用放射配基[3H]PK11195单点结合实验测定PBRs特异结合活性,通过受体饱和实验和Scatchard作图得到最大结合容量Bmax值和平衡解离常数Kd值。结果与3月龄组大鼠相比,24月龄组的大脑皮层线粒体及外周血小板膜PBRs特异结合活性均显著上升(P<0.001)。饱和实验结果表明,24月龄组大鼠大脑皮层线粒体PBRs的受体容量(Bmax)升高而受体亲和力明显下降,Kd值显著增高(P<0.001)。结论老龄鼠PBRs容量上升而亲和力下降,可能参与脑老化进程。外周血小板膜[3H]PK11195结合活性与脑内该指标的变化一致。

应激大鼠心肌线粒体三种氧化酶活性变化及β受体阻滞剂对其的影响

目的：进一步研究应激所致的心肌能量代谢变化及造成心肌损伤的机制．方法：将大鼠放置温水［（２０±１）℃］浸泡应激．在应激０．５，１，２，４，６ｈ后采用差速离心法分离线粒体，用氧电极法测定ＮＡＤＨ氧化酶、琥珀酸氧化酶、细胞色素Ｃ氧化酶的活性及其变化和运用β受体阻滞剂对其的影响．结果：不同应激状态下氧化酶的活性与正常组比较相差显著，在应激开始阶段活性增高而后期逐渐下降．运用β受体阻滞剂后其变化趋势无变化，但使应激后氧化酶活性下降时间向后推移．结论：应激后线粒体呼吸功能变化有一定规律．应用β受体阻滞剂不能阻断其变化过程．

迁移体的产生、功能及应用

迁移体是在细胞迁移过程中产生的一种直径为0.5~3.0μm的单层膜囊泡结构,其内部还有一些含有核酸、蛋白质、脂质等生物活性物质的微小囊泡。迁移体在细胞间通讯过程中发挥重要作用,参与并调控多种生理和病理过程。尿液中迁移体的增加可以作为足细胞早期损伤的标志物,从而为足细胞病的临床诊断和治疗提供辅助。本文从迁移体的发现、发生机制、研究手段、生物学功能和应用潜能,以及与其他细胞外囊泡的异同六个方面进行了综述,探讨了迁移体的研究进展及未来可能的研究方向。

二硫化碳对实验大鼠神经系统线粒体影响的实验研究

目的探讨二硫化碳(CS2)染毒对大鼠线粒体复合酶以及ATP酶活力的影响。方法健康雄性Wistar大鼠20只随机分成对照组和CS2组,每组10只,CS2组大鼠腹腔注射CS2玉米油溶液,开始4周染毒剂量为150mg/kg、1次/d、6次/周,后4周染毒剂量为300mg/kg、1次/d、6次/周。对照组腹腔注射等量的玉米油溶液。染毒结束后进行神经(感觉和运动)功能测试。提取脑组织、脊髓、坐骨神经的线粒体进行线粒体复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和ATP酶的活力检测。结果神经功能的测试结果表明CS2组染毒4周后在热板仪上停留的时间由对照组的12.48s延长到了22.35s,到染毒8周时,其在热板仪上停留的时间比对照延长了182%;但在后肢撑力实验中,只有8周后肢撑力指数增加明显,是对照组的125%。另外坐骨神经中线粒体复合酶Ⅲ和Ⅳ的活力明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。染毒大鼠脑组织和脊髓中Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活力均呈下降的趋势,尤其是在脊髓中下降尤为严重;但在坐骨神经中只有Ca2+-Mg2+-ATPase的活力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论线粒体酶损伤可能参与CS2导致的神经系统毒作用。

胆管癌患者癌组织与血清中XIAP、SMAC水平的变化及其临床意义

目的:探讨XIAP、SMAC在胆管癌组织中表达与两者在胆管癌患者血清中水平以及两者的临床意义。方法:用免疫组化方法检测54例胆管癌患者在胆管癌组织及其癌旁组织中XIAP与SMAC的表达,用ELISA法检测25例胆管癌患者与15例健康人血清中XIAP与SMAC的水平。分析两者表达与患者临床病理因素的关系,以及患者手术前后两者水平的变化。结果:胆管癌组织中XIAP表达阳性率明显高于癌旁组织(81.45%vs.30.00%,P<0.05),而SMAC表达阳性率明显低于癌旁组织(38.89%vs.80.00%,P<0.05)。XIAP表达与胆管癌病理分型及是否伴有淋巴结转移有关,而SMAC表达与胆管癌TNM分期、是否伴有淋巴结转移有关(均P<0.05);在胆管癌组织中XIAP、SMAC表达呈负相关(r=-0.327,P<0.05)。胆管癌患者术前血清XIAP水平明显高于健康对照人群,而血清SMAC水平明显低于健康对照人群(均P<0.05);术后两者水平术后趋向正常。XIAP与SMAC在胆管癌患者癌组织中的表达与其在血清中的水平具有一致性(r=0.381,P=0.025;r=0.623,P=0.000)。结论:胆管癌组织中XIAP表达升高,而SMAC表达降低;两者联合检测对胆管癌早期诊断、治疗效果及预后的判断有一定意义。

线粒体DNA拷贝数与相关因素的交互作用对煤矿工人高血压的影响

目的 探讨煤矿工人线粒体DNA（mtDNA）拷贝数与相关因素对高血压的影响及其交互作用。方法 采用病例对照研究设计，选取大同煤矿集团中378例患有高血压病的煤矿工人作为病例组，非高血压煤矿工人325例作为对照组。通过问卷调查收集研究对象基本情况、生活饮食习惯等信息，采用荧光定量PCR方法对外周血mtDNA进行扩增，定量分析mtDNA拷贝数的变异情况，采用logistic回归模型分析高血压的相关影响因素，并进行交互作用分析。结果 相对于mtDNA拷贝数0-5.67组，具有较高水平的mtDNA拷贝数者高血压患病风险较低，但差异无统计学意义（P=0.414）。饮酒（OR=1.80，95% CI：1.26-2.56）、高血压家族史（OR=1.74，95% CI：1.20-2.50）、倒班（OR=0.69，95% CI：0.48-0.99）、文化程度（P=0.012）和家庭收入（P〈0.001）是高血压患病的相关因素。构建mtDNA拷贝数与相关因素的交互作用项，分析结果显示，饮酒与mtDNA拷贝数、高血压家族史与mtDNA拷贝数、家庭收入与mtDNA拷贝数存在相乘的交互作用。饮酒是高血压患病的危险因素［1.77（1.25-2.50）］，mtDNA高拷贝数与其交互作用使高血压患病风险降低（交互作用OR=1.20，95% CI：1.07-1.35）；高血压家族史是患高血压病的危险因素［1.81（1.26-2.59）］，mtDNA高拷贝数与其交互作用使患高血压患病风险降低（交互作用OR=1.24，95% CI：1.09-1.41）；家庭收入是高血压的保护因素［0.55（0.46-0.66）］，mtDNA高拷贝数与其交互作用使其对高血压患病的保护作用减弱（交互作用OR=0.90，95% CI：0.86-0.94）。结论 不同mtDNA拷贝数的研究对象高血压患病风险无统计学意义，但mtDNA高拷贝数与饮酒、家庭收入、高血压家族史之间的相乘交互作用使后三者对高血压的影响降低。

HPLC测定三个海拔高度大鼠血清中ATP含量的比较研究

本文采用高效液相色谱技术(HPLC)测定了三个海拔高度大鼠血清中三磷酸腺苷(ATP)的含量。于海拔4900m地区大鼠血清中ATP的含量明显低于海拔2260m及320m地区(P<0.001及<0.01);后两者间虽存有差别,但无显著性意义(P<0.05)。表明在重度缺氧条件下,动物血清中ATP含量明显减少。ATP是直接能为机体所利用的高能化合物,机体对缺氧适应的关键是保持高能化合物于正常水平。本文对高原缺氧条件下能量代谢的动态变化及其生理、病理学基础进行了讨论。

食管壁细胞线粒体变化规律及临床意义

通过对１８～３１周胎儿食管下段（ＬＥＳ）及食管体环状平滑肌内线粒体超微结构电镜图像三维结构参数计算，发现随着胎儿月龄增加，ＬＥＳ平滑肌细胞内线粒体体密度（Ｖｖ）、面密度（Ｓｖ）、平均体积（ ）及平均截面积（ ）均增大，长短轴比（Ｑ）变小，数密度（Ｎｖ）变化不显著。ＬＥＳ平滑肌与食管体平滑肌相比，其细胞线粒体的Ｖｖ、Ｓｖ、Ｎｖ、 、 更大，而Ｑ较小。这是ＬＥＳ括约功能及其不断发育成熟的结构基础，也是防止胃食管返流机制逐渐发育完善的重要原因。

罗卜（Raphanus sativus L．）雄性不育系小孢子发生中的酶细胞化学初探

采用酶细胞化学技术探讨了萝卜雄性不育系６４Ａ小孢子发生不同阶段中琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）的定位及其活性的变化情况．结果表明ＳＤＨ活性反应物主要分布于线粒体的内膜和嵴．保持系６４Ｂ小孢子发生过程中，线粒体的ＳＤＨ反应一直存在，随着小孢子发育其活性还有所增强．在不育系中，单核早期小孢子的线粒体ＳＤＨ活性较明显；单核晚期时小孢子内线粒体减少，其ＳＤＨ活性也渐弱．以后，小孢子的发育受阻，以致相当于二胞花粉时期的不育系花药内已无花粉．

α_1受体对不同时相心肌线粒体的影响

目的:研究α1 受体的活化与不同时相心肌线粒体的关系。方法:Langendorff灌流模拟心肌缺血和再灌注,观察激活或阻断α1 受体不同时相心肌线粒体的变化。结果:缺血前使用 phenylephrine线粒体损害程度最低,与正常对照组比较差异无统计学意义;缺血期间加用 phenylephrine,损害程度最重;再灌注时使用 pheny lephrine,损害程度介于上述两组之间。全程使用 phenylephrine,心肌损害程度与预处理组相似;prazosin缺血前使用对线粒体无影响;缺血期间加用prazosin损害程度与正常对照组相差不大;再灌注时使用prazosin,损害程度明显加重,程度仅次于全程给药组。结论:缺血前激活、缺血期间阻断α1 受体可保护心肌。再灌注时激活α1 受体效应不明确,但阻断α1 受体有害。