线粒体tRNA^（Leu（UUR））基因突变糖尿病──患病率估测、临床特点及基因诊断途径

用基因诊断技术在２０７例无亲缘关系的非胰岛素依赖型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者中，筛查线粒体ｔＲＮＡＬｅｕ（ＵＵＲ）基因突变糖尿病，２例基因诊断阳性。本病在具不常见临床表现的ＮＩＤＤＭ亚群中占２．４％～１１．１％。对２例阳性者的家系进行临床及基因分析，检测２５个家系成员中，１０个基因诊断阳性。提出对于起病早、对口服降糖药继发失效需改用胰岛素治疗、有胰岛β细胞功能明显减退、消瘦、神经性耳聋、有糖尿病及／或听力障碍家族史且符合或不能除外母系遗传一种或多种情况的ＮＩＤＤＭ者应疑及本病。可用方法简便、易于判断的等位基因特异引物扩增（ＡＳＰＡ）或ＰＣＲ２０６ｂｐ／ＡｐａＩ或ＨａｅⅢ技术进行临床基因诊断。

人线粒体tRNA^(Leu(UUR))基因A3243G点突变对其亮氨酰化活性的影响

化学法合成人线粒体野生型与A3243G点突变型tRNA^(Leu(UUR))基因,体外转录生成相应的tRNA^(Leu(UUR)),表达并纯化人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS),用mtLeuRS催化野生型与突变型tRNA^(Leu(UUR))与亮氨酸结合,分别检测两种类型tRNA^(Leu(UUR))的氨酰化动力学常数。结果表明,野生型tRNA^(Leu(UUR))的K_m/K_(cat)仅为突变型tRNA^(Leu(UUR))的63.9％,A3243G点突变使tRNA^(Leu(UUR))接受亮氨酸的能力明显下降,提示此为A3243G点突变致病机制之一。

人线粒体tRNA^(Leu(UUR))基因氧化损伤与修复研究

人mtDNA比核DNA更易受到自由基的氧化损伤 ,这些损伤可以被线粒体内的DNA修复机制所修复 ,损伤与修复是决定突变是否产生的两个重要因素 .为了确定氧化损伤与损伤后修复对mtDNA突变的具体影响 ,采用四氧嘧啶处理LO2 细胞 ,这种试剂进入细胞后 ,经氧化还原反应生成的自由基与线粒体自身代谢产生的自由基类似 ,然后观察自由基对细胞mtDNA的氧化损伤与损伤后DNA修复的动力学变化 .由于线粒体的正常功能为修复机制所必需 ,采用MTT细胞活力实验检测不同浓度四氧嘧啶处理下线粒体酶活力 ,发现 9mmol/L四氧嘧啶培养细胞 1h后 ,线粒体琥珀酸脱氢酶功能在撤去药物后 0 ,2 ,8和 2 4h时间点均无明显变化 .提取各组细胞的mtDNA ,用EndoⅢ和Fgp两种酶切除受氧化损伤的核苷酸 ,然后用碱性琼脂糖凝胶电泳分离大小不等的mtDNA ,进行DNA印迹实验 ,地高辛 抗体 碱性磷酸酶系统显色 ,检测完整与断裂的mtDNA量 ,利用Poisson公式 (s=-lnP0 /P ,P0 为未断裂链光密度值 ,P为所有链光密度值总和 )计算一个mtDNA分子的平均损伤频率 ,结果显示 ,9mmol/L四氧嘧啶处理细胞 1h ,链平均损伤频率由对照的 0 11个 /分子增加至 5 6 0个 /分子 ,明显增加了mtDNA上核苷酸的氧化损伤 ,除去药物后 8h ,绝大部分损伤可被修复 ,损伤频率减至

Gene cloning,expression and purification of human mitochondrial tRNA^(Leu(UUR)) and its mutant

Genes of human mitochondrial tRNALeu(UUR) (mtRNALeu(UUR)) and itsmutant (mtRNALeu(M)) were synthesized and inserted into the plasmid pGEM-9Zf(-) respectively. E.coli JM 109 was transformed by the recombinant plasmids containing the target genes. The mtRNALeu(UUR) and mtRNALeu(M) were expressed up to 19.10% and 17.76% of total small RNA respectively. They were purified to 54% homogeneity by DEAE-sepharose-CL4B column chromatography and finally repurified by 15% PAGE/urea. Their kinetic parameters for E.coli LeuRS were measured. The results showed that the value of kcal / Km of mtRNALeu(M) was about one fifth of that of mtRNALeu(UUR) and indicated the leucine acceptability of mtRNALeu(M) was much lower than that of mtRNALeu(UUR)

线粒体DNA3243、3316、3394位点突变与精神分裂症相关分析

目的分析线粒体tRNALeu(UUR)基因3243位点及ND1基因3316、3394位点突变对精神分裂症(SZ)发病的影响。方法采用PCR扩增、限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分型检测、DNA测序等方法,对随机抽取的无亲缘关系的250例患者(SZ组)和292例对照组的外周血mtDNA进行3243、3316和3394位点的突变检测。结果在SZ组中发现8例3316G/A突变,对照组中3例,两组相比差异无统计学意义(P=0.138)。在SZ组中发现15例3394T/C突变,对照组中有4例,两组相比差异有统计学意义(P=0.007)。在精神分裂症患者组和对照组中均未发现3243A/G突变。结论 mtDNA3394T/C突变可能与SZ发生有一定关系,mtDNA 3243A/G、3316G/A突变可能与SZ发生无关。

线粒体tRNA亮氨酸基因第3251位点A到G点突变致线粒体肌病伴高乳酸血症1家系报告

线粒体tRNA亮氨酸基因(mitochondrial tRNALeu(UUR)gene(UUR,R=A or G),MT-TL1,OMIM:590050)突变能够导致线粒体疾病。MT-TL1包含线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)第3230-3304碱基对。目前已经发现的MT-TL1的致病性点突变有:3242 G>A,3243 A>G,3249 G>A,3250 T>C,3251 A>G,3256 C>T,3260 A>G,3271 T>C,3274 A>C,3290 T>C,3303 C>T等[1~12]。

一个线粒体基因突变糖尿病家系的三年随访研究

目的探讨线粒体基因tRNALeu(UUR)m t3243A→G突变糖尿病的临床特征及病情演变。方法回顾性分析一线粒体基因tRNALeu(UUR)m t3243A→G突变糖尿病家系成员共10例,随访3年,观察其临床特点及胰岛功能变化。结果随访3年后tRNALeu(UUR)m t3243A→G突变者体质指数、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)较随访前显著下降,1例出现耳聋症状加重,2例出现了蛋白尿,2例演变为糖尿病,3例进展为糖耐量异常(IGT),其中1例突变阳性者新生1女也为该基因突变阳性。结论线粒体基因tRNALeu(UUR)m t3243A→G突变者是糖尿病的高危人群,易演变为IGT或糖尿病,其临床表现呈一定的异质性。

线粒体tRNA^（Leu（UUR））基因突变糖尿病的基因诊断

线粒体ｔＲＮＡＬｅｕ（ＵＵＲ）基因核苷酸（ｎｔ）３２４３Ａ→Ｇ点突变临床上可致呈母系遗传（ｍａｔｅｒｎａｌｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）方式传递的非胰岛素依赖型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）。突变形成ＡｐａＩ酶切位点，用聚合酶链反应伴ＡｐａＩ酶解可进行临床基因诊断。作者报道以此方法筛查４３例ＮＩＤＤＭ中见到的具此种突变的第一个中国人家系。家系３代中５例ＮＩＤＤＭ（４例伴耳聋）基因诊断均为阳性。７例非糖尿病成员中，６例基因诊断阴性。对１例基因诊断阳性的１３岁非糖尿病男孩，结合基因突变在家系内传递情况，作出发病前诊断。在中国人中发现本病，为中国人ＮＩＤＤＭ遗传异质性提供了确实证据。

母系遗传糖尿病中线粒体tRNA^(leu(UUR))基因突变的研究

为了解线粒体ｔＲＮＡｌｅｕ（ＵＵＲ）基因ｎｔ３２４３Ａ→Ｇ突变在中国人家族性糖尿病中的发生率及该类糖尿病的临床特征，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合限制性内切酶酶切分析，对５８例有母亲患病史（第１组）、３２例有父亲患病（第２组）、４８例有兄弟姐妹患病史（第３组）和５０例无家族史（第４组）的糖尿病患者进行该基因的筛查。在第１组和第３组患者中发现５例突变基因阳性者，并对其中２例先证者的家系成员进行临床和基因分析。结果显示该突变在家族中与糖尿病和耳聋共分离。提示这是一种独特的糖尿病亚型，存在于中国人ＩＤＤＭ和ＮＩＤＤＭ群体中，在母系遗传糖尿病中有较高的发生率。

糖尿病家系的线粒体基因tRNA^Leu（UUR）A3243G突变分析

目的分析线粒体基因tRNA^Leu（UUR）A3243G突变的糖尿病家系中发病规律。方法筛选临床疑似线粒体糖尿病家系，采用PCR、DNA直接测序技术对3个家系19例临床疑似线粒体基因突变糖尿病家系进行线粒体基因突变高发区域tRNA^Leu（UUR）A3243G基因的检测。结果3个家系发现与糖尿病发病有关的突变位点均位于nt3243A→G突变，且家系中大部分患者伴有消瘦、耳聋、G细胞功能低下、发病年龄低的特点。结论线粒体tRNA^Leu（UUR）A3243G基因3243位点A→G突变可导致糖尿病和耳聋。

线粒体tRNA^(Leu(UUR))基因点突变与1型糖尿病

目的 线粒体ｔ Ｒ Ｎ Ａ Ｌｅｕ（ Ｕ Ｕ Ｒ） 基因３２４３ 位点 Ａ→ Ｇ 突变是糖尿病的致病基因之一。本研究是为了了解该基因的突变在中国１ 型糖尿病患者中的情况以及与自身免疫导致１ 型糖尿病有无关联。方法 对１１６ 例随机收集的１ 型糖尿病患者用聚合酶链反应限制性内切酶消化作该点突变的筛选；８２ 例患者同时进行了谷氨酸脱羧酶（ Ｇ Ａ Ｄ） 抗体的测定。结果 发现１ 例该点突变（０ ．８６ ％ ） ，４８ 例 Ｇ Ａ Ｄ 抗体阳性（５８ ．５ ％ ） 。线粒体ｔ Ｒ Ｎ Ａ Ｌｅｕ（ Ｕ Ｕ Ｒ） 基因突变携带者 Ｇ Ａ Ｄ 抗体阴性，其家系成员糖尿病有不同的发病方式，但均表现为胰岛素缺乏。结论 线粒体ｔ Ｒ Ｎ Ａ Ｌｅｕ（ Ｕ Ｕ Ｒ） 基因异常所致糖尿病表现为胰岛素缺乏可能与自身免疫胰岛炎无关，而是一种独特的糖尿病亚型。

线粒体DNA3243、3316点突变与2型糖尿病

目的 研究2型糖尿病患者中线粒体t RNAL eu( UUR)基因32 4 3A/ G突变和NADH脱氢酶亚单位1基因(ND1)基因3316 G/ A突变的发生频率及其与2型糖尿病的相关性。方法 应用聚合酶链反应及限制性片段长度多态性技术检测2 2 5例中国云南2型糖尿病患者和195名无糖尿病家族史的健康对照者有无32 4 3A/ G突变和3316 G/ A突变,并经DNA直接测序确证。结果 2型糖尿病患者中3316 G/ A突变者5例(2 .2 2 % ) ,195例对照者中突变者2例(1.0 3% ) ,突变发生率在两组间差异无统计学意义(P=0 .4 5 76 ) ;两组中无线粒体32 4 3A/ G突变。结论 线粒体t RNALeu( UUR) 基因32 4 3A/ G突变在中国云南2型糖尿病人群中发生频率低,可能不是云南人群中2型糖尿病的常见病因。线粒体ND1基因3316 G/ A突变可能仅为人群中线粒体基因组的正常多态。其他的遗传、环境及子宫内因素需要进一步研究。

湖北土家族一糖尿病伴耳聋家系的遗传学研究

目的分析湖北土家族一糖尿病伴耳聋家系,确定其遗传方式;检测线粒体基因组中tRNAleu(UUR)基因3243A→G突变,阐明该家系患者发病与线粒体基因突变的关系。方法采集家系部分成员外周血提取DNA,利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,检测家系部分成员的线粒体基因突变。结果经PCR-RFLP分析,家系中8名患者tRNAleu(UUR)基因均存在3243A→G异质性突变,患者的2名正常后代则没有该突变。结论该家系为母系遗传,线粒体tRNAleu(UUR)基因3243A→G突变是导致患者发病的原因。

线粒体糖尿病的分子发病机制

尽管已发现线粒体糖尿病有多个致病点突变，但tRNALeu（UUR）3243A—G突变仍是目前国际上惟一公认的位点。该基因突变遵循严格的母系遗传且各组织细胞突变型比例存在异质性。该基因突变引起胰岛β细胞胰岛素分泌功能障碍，可能引起外周胰岛素抵抗。胰岛β细胞过早的功能衰退和凋亡，胰岛素合成减少以及ATP／ADP介导的胰岛分泌功能障碍可能是该位点突变致糖尿病发生、发展的主要原因。本文就该突变类型所致糖尿病的分子发病机制作一综述。

MT-TL1基因m.3252A>G变异致MELAS综合征一例并文献复习

线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作综合征(mitochondrial encephalopathy,lactic acidosis,and stroke-like episodes,MELAS)是最常见的原发性线粒体疾病之一。本文报道了1例罕见的由m.3252A>G(MT-TL1基因)突变导致的MELAS综合征。先证者为6岁女童,以反复抽搐和高乳酸血症为主要表现,线粒体DNA(mtDNA)基因测序示患儿及其母亲和外婆均携带m.3252A>G(MT-TL1基因)变异,该变异在患儿外周血和尿沉渣中的异质率分别为66.53%和97.42%,明显高于母系亲属。结合国外已报道的3个家系资料,该变异评级为致病性变异。通过复习国内外文献,探讨了MT-TL1基因致病变异的基因型-表型相关性。

家族性2型糖尿病线粒体基因突变发生率及其临床意义

目的探讨家族性2型糖尿病(T2DM)线粒体基因tRNA^(Leu(UUR))mt3243A→G突变发生率及突变家系成员病情演变与临床特征。方法采用PCR/ApaI酶切法对66个家族性T2DM的家系成员共计518人进行突变筛查,并随访3年,观察其临床特点及胰岛β细胞功能变化。结果共发现突变阳性12例,其中3例为已确诊的T2DM患者,1例为糖耐量减低(IGT)患者,8例为糖耐量正常(NGT)者。随访3年后突变阳性者的耳聋症状加重,BMI、HOMA-IR下降,部分成员出现了白蛋白尿,2例演变为DM,3例进展为IGT,其中一例突变阳性者新生一女也为该基因突变阳性。结论家族性T2DM患者中线粒体基因突变发生率约为2.7%,且突变患者的临床表现呈一定的异质性;线粒体基因突变阳性的NGT者是糖尿病高危人群,易演变为IGT或DM,而IGT者易进展为DM。