新型蛋白酶体抑制剂MLN2238对胃癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的探讨新型蛋白酶体抑制剂MLN2238对胃癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法取对数生长期胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901,按照MLN2238终浓度0、25、50、75、100 nmol/L分为5组,处理24、48、72 h后采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测各孔吸光值并计算存活率以评价MLN2238对胃癌细胞的增殖抑制作用;处理48 h后经膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双标或PI标记后,采用流式细胞术检测胃癌细胞凋亡率及细胞周期的变化。结果相同作用时间(24、48或72 h)下,随着MLN2238浓度的增加,MLN2238处理后BGC-823、SGC-7901细胞的存活率降低(P<0.05);相同MLN2238浓度(25、50、75或100 nmol/L)情况下,除100 nmol/L MLN2238作用24 h和48 h的BGC-823细胞存活率间无统计学差异外(P>0.05),随MLN2238作用时间的延长,MLN2238对BGC-823、SGC-7901细胞的增殖抑制作用也基本呈递增趋势(P<0.05);MLN2238处理BGC-823、SGC-7901细胞48 h后,除75、100 nmol/L MLN2238作用BGC-823细胞各周期细胞比例的差异无统计学意义外(P>0.05),随MLN2238浓度的增加,BGC-823、SGC-7901细胞的凋亡率、G0/G1期细胞比例均升高,S、G2/M期细胞比例降低,且MLN2238的促凋亡效应和促细胞周期G0/G1期阻滞作用呈浓度依赖性(P<0.05)。结论 MLN2238可抑制胃癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡及G0/G1期阻滞,MLN2238的以上作用与作用时间和作用浓度有关。

Aurora A激酶抑制剂MLN8237对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的观察Aurora A激酶抑制剂MLN8237对体外培养的人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法取乳腺癌MCF7细胞分为两组,观察组分别加入0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L MLN8237,对照组不加MLN8237。用MTT法检测各组细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期,Western blotting法检测磷酸化Aurora A(p-Aurora A)激酶和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及细胞周期相关蛋白Cyclin B1的表达,AnnexinⅤ-FITC与PI双染法检测细胞凋亡率。结果观察组随MLN8237浓度和培养时间增加,细胞增殖抑制率增加,10μmol/L MLN8237作用48 h的细胞增殖抑制率最高,0.01、0.1、1、10μmol/L MLN8237作用24、48 h的细胞增殖抑制率均高于对照组(P均<0.05)。与对照组比较,观察组随MLN8237浓度增加,G0/G1期、S期细胞比例降低,G2/M期细胞比例升高。观察组各浓度与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组比较,观察组随MLN8237浓度增加,p-Aurora A激酶、Bcl-2表达降低,Bax表达升高。与对照组比较,观察组随MLN8237浓度增加,细胞凋亡率增加,10μmol/L MLN8237作用24 h的细胞凋亡率最高(P均<0.05)。结论 MLN8237能够抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖,并诱导细胞凋亡。

MLN4924对家蚕BmN细胞增殖及基因表达的影响

以神经前体细胞表达发育下调蛋白8修饰抑制剂MLN4924处理家蚕Bm N细胞,通过MTT法、Annexin V-FITC和数字表达谱研究了MLN4924对家蚕Bm N细胞毒性和基因表达的影响.结果表明:浓度为1～10μmol/L时,MLN4924对家蚕Bm N细胞未发现明显的细胞毒性,也未观察到细胞凋亡,BmN细胞对MLN4924具有较高的耐受性;数字表达谱结果发现MLN4924处理BmN细胞会引起家蚕基因表达的变化,一共发现了136个差异基因,其中76个基因表达上调,60个基因表达下调;生物信息学分析发现差异基因参与了脂肪消化和吸收、溶酶体、类固醇代谢等生物过程.

MLN64基因及在乳腺癌发生发展中作用的研究进展

MLN54基因定位于17号染色体的q12-q21区，编码的MLN64蛋白为一含445个氨基酸残基的跨膜蛋白。MLN64蛋白的C端域与StAR蛋白有高度同源性，N端域可使MLN64蛋白定位于次级内体膜上。MLN64蛋白参与胆固醇的转运和类固醇激素的合成。MLN64与C-erbB-2基因相似，在乳腺癌中过表达，可以影响乳腺癌细胞的生物学特点。研究表明MLN64的高表达可能通过增加肿瘤内的类固醇激素合成促进乳腺癌的生长和进展，也被认为是乳腺癌预后的一个预测因子。

MLN4924对紫杉醇耐药的前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究MLN4924对紫杉醇耐药的前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响,从而为紫杉醇耐药前列腺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法:不同浓度的MLN4924作用紫杉醇耐药的前列腺癌细胞PC3-TxR和DU145-TxR 48和72小时后,采用MTS检测细胞活力。Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、CDT1、p27以及EMT标志物水平。结果:MLN4924能够显著抑制PC3-TxR和DU145-TxR细胞的增殖,并且具有时间和浓度的依懒性。Western blot结果显示MLN4924作用后显著增加细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3、CDT1和p27的表达。结论:MLN4924能够显著抑制紫杉醇耐药的前列腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡,其相关机制为MLN4924可通过上调p27蛋白表达促进紫杉醇耐药的前列腺癌细胞凋亡。

MLN4924对宫颈癌Hela细胞株增殖和凋亡的影响

目的 观察选择性神经前体细胞发育相关受控表达分子(NEDD8)活化酶(NAE)抑制剂MLN4924对人宫颈癌Hela细胞株增殖和凋亡的影响。方法 使用不同浓度MLN4924(0.5、1.0、2.0μmol·L^(-1))加入Hela细胞株处理24 h,以不加MLN49240为对照组。免疫印迹法(WB)检测泛素连接酶蛋白(Cullins-1)、S期激酶相关蛋白(Skp2)、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(P-IκBα)及p50的表达水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平。MTT比色法检测经MLN4924处理的Hela细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。结果 MLN4924对宫颈癌Hela细胞增殖有显著的抑制作用,随着剂量的加大抑制作用更明显,且有剂量依赖性;Hela细胞Cullins-1、Skp2及p50表达下调,P-IκBα上调(P<0.05);各处理组IL-6、TNF-α较对照组降低(P<0.05),S期细胞百分率较对照组升高(P<0.05),大量四倍体细胞形成,细胞生长周期受阻;细胞凋亡率也随MLN4924剂量增大而升高。结论 NAE抑制剂MLN4924对人宫颈癌Hela细胞的增殖有明显抑制作用,诱导Hela细胞周期阻滞和凋亡。

大鼠Gast和Mln mRNA荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立一种逆转录-实时定量PCR(R T-Q PCR)检测大鼠胃组织中胃泌素(Gast)和胃动素(Mln)m R N A表达的方法。方法:提取大鼠胃组织总RNA,逆转录合成c DNA,利用SYBRGreen荧光染料法实时检测Gast和Mlnm RNA的表达水平。通过溶解曲线分析检测特异性,以管家基因β-actin为内参对Gast和Mln进行定量分析。结果:建立的大鼠Gast和Mlnm RNART-QPCR检测方法具有良好的特异性和敏感性。结论:成功建立RT-QPCR检测Gast和Mlnm RNA基因表达的方法。

MiR-34a-5p在MLN8237诱导神经母细胞瘤细胞衰老中的作用机制

目的研究小分子AURKA抑制剂MLN8237诱导神经母细胞瘤细胞衰老的作用机制。方法利用细胞转染的方法改变SK-N-SH细胞中miR-34a-5p的表达水平,通过SA-β-gal染色方法及流式细胞术检测细胞衰老及细胞周期情况。运用CCK8检测不同处理下细胞增殖的变化情况。RT-PCR及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法用来检测细胞中相关基因及蛋白的表达情况。结果(1)MLN8237在SK-N-SH细胞中可以通过激活P53/P21通路诱导细胞衰老,同时引起miR-34a-5p表达上调(P值均<0.05)。(2)SA-β-gal染色及流式检测细胞周期显示,过表达miR-34a-5p可以引起SK-N-SH细胞衰老,靶向调控衰老相关靶基因SIRT1的表达,并导致P53、P21蛋白及mRNA表达升高(P值均<0.05),激活P53/P21衰老通路。(3)将miR-34a-5p抑制剂与MLN8237联用后,与单用MLN8237相比可以减少衰老细胞,降低P53、P21的表达(P值均<0.05),并抑制P53/P21衰老通路,且CCK8结果提示,两者联用可以显著减弱MLN8237对SK-N-SH细胞的增殖抑制作用(P值均<0.05)。结论在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中MLN8237是通过激活P53/miR-34a-5p/SIRT1反馈环路来诱导细胞衰老的过程。

NEDD8共价修饰抑制因子MLN4924对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖和凋亡的影响

目的:探讨神经前体细胞发育相关受控表达分子8(NEDD8)共价修饰抑制因子MLN4924对人卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并分析其可能机制。方法:使用不同浓度MLN4924(0、0.125、0.25、0.5μmol/L)处理人卵巢癌细胞株SKOV3 4 h,免疫印迹法检测PAR3、HER2、Neddylated-cullins、P-IκBα的表达水平;同时取细胞培养上清用ELISA检测IL-6的分泌。不同浓度MLN4924处理SKOV3细胞72 h,CCK8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。结果:MLN4924作用4 h时,能够使Neddylated-cullins下降、P-IκBα积聚,IL-6分泌减少,而PAR3、HER2表达水平变化不显著。MLN4924在0.125、0.25和0.5μmol/L的浓度下处理SKOV3细胞72 h时,对细胞增殖有明显的抑制作用,并且随着剂量的加大,抑制效果也显著提高;同时加药组S期细胞百分率相较于对照组明显升高,且形成大量四倍体,使之没有完整的细胞周期;细胞凋亡率也随MLN4924剂量增大而升高。结论:NEDD8修饰特异性抑制剂MLN4924能够明显抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖,诱导细胞周期阻滞和凋亡。上述效应可能与NF-κB通路活性受到抑制和IL-6表达下降有关。

MLN4924促进人肺腺癌细胞株A549凋亡的机制研究

目的:观察MLN4924对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响,探讨MLN4924促进凋亡的作用机制。方法:不同浓度的MLN4924作用细胞不同时间后,采用CCK-8检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342荧光染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、NF-κB p65及CDT1相对表达量。结果:MLN4924能够明显抑制A549细胞的增殖,并且具有浓度和时间依赖性。流式细胞仪检测结果显示药物作用后,细胞被阻滞在S期。Western blot结果显示药物作用后细胞内Caspase-3、CDT1蛋白的表达量增加,而NF-κB p65的表达量减少。结论:MLN4924能够明显抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡,其相关机制为MLN4924可阻滞细胞于S期,增加Caspase-3蛋白表达,抑制NF-κB通路的激活。

神经前体细胞表达下调因子8类泛素修饰抑制因子MLN4924对单核巨噬细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的观察神经前体细胞表达下调因子8（NEDD8）类泛素修饰抑制因子MLN4924对单核巨噬细胞白血病细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法 MLN4924 0.25~4.0μmol·L-1与U937细胞、THP-1细胞、Mo7e细胞和RAW264.7细胞作用24 h,采用MTT法检测细胞存活。MLN4924 0.25~8.0μmol·L-1与RAW264.7细胞作用24 h,用Western蛋白质印迹法检测NEDD8类泛素化修饰的主要底物cullin蛋白表达水平。MLN4924 0.5μmol·L-1作用于RAW264.7细胞24 h,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。结果 MLN4924 0.25~4.0μmol·L-1作用24 h对RAW264.7细胞、U937细胞、THP-1细胞和Mo7e细胞增殖具有抑制作用,IC50分别为0.52,3.11,2.89和0.76μmol·L-1;对正常小鼠骨髓巨噬细胞增殖无明显影响。MLN4924 0.25~8.0μmol·L-1作用24 h,NEDD8类泛素化修饰的cullin蛋白表达减少（P〈0.01）,表明RAW264.7细胞NEDD8修饰逐渐减少。MLN4924 0.5,1.0和2.0μmol·L-1作用于RAW264.7细胞24 h,G0/G1期细胞百分率由正常对照组的（61.3±1.3）%分别升高到（64.5±1.5）%（P〈0.05）,（69.5±2.3）%（P〈0.01）和（72.8±1.7）%（P〈0.01）,细胞凋亡率由正常对照组的（1.5±0.3）%分别升高到（2.3±0.5）%,（4.3±0.9）%（P〈0.05）和（7.5±0.8）%（P〈0.01）。结论 MLN4924能够明显抑制单核巨噬细胞白血病细胞增殖,并诱导其细胞周期阻滞和细胞凋亡。

家蚕暗化型(mln)品种育成初报

家蚕暗化型 (mln)品种 ,蛾为灰黑色 ,把暗化型基因导入现行生产用种 ,与常规白蛾组配 1代杂交种 ,可把杂交种的杂交彻底率提高到 99%以上 ,提高了蚕种质量。

极光激酶A抑制剂MLN8237对宫颈鳞状细胞癌细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探讨极光激酶A(Aurora A,Aurora A)抑制剂MLN8237对人宫颈鳞状细胞癌细胞(HCC94)顺铂(cisplatin)化疗敏感性的影响。方法采用不同浓度MLN8237联合顺铂在不同时间作用于HCC94细胞,用四唑盐(MTT)比色法观察药物对细胞生长的抑制,蛋白质印迹法(Western Blotting)分析胞质内P21wap1、P53、P(S315) P53、Aurora A和P(288) Aurora A蛋白的表达;用流式细胞术检测细胞凋亡。结果MLN8237(10~160μmol/L)或顺铂(10~160μmol/L)均明显抑制HCC94细胞的生长(P<0.05),并引起细胞凋亡;小剂量MLN8237(5、10和20μmol/L)和顺铂(2.5、5、10和20μmol/L)联合应用,与单用顺铂比较,可明显增加细胞增殖抑制率和细胞凋亡率(均P<0.05)。与对照组比较,MLN8237处理组P21wap1和P53表达显著增高,P(S315) P53和P(T288) Aurora A表达显著降低,Aurora A表达不改变。与对照组比较,顺铂组P21wap1/Cip1和P53表达轻微增高,P(S315) P53表达轻微降低,Aurora A和P(T288) Aurora A蛋白表达不改变。与各单药组和对照组比较,联合组对以上各种蛋白的影响作用显著加强。结论小剂量MLN8237可增强宫颈鳞状细胞癌细胞HCC94对顺铂的敏感性,增强化疗疗效。

极光激酶抑制剂MLN8237的合成方法改进

以2-氨基-5-氯苯甲酸为起始原料,用改进方法经十步反应合成了极光激酶抑制剂MLN8237,总产率12.3%,其结构经1H NMR和MS确证。

MLN4924导致的成熟脂肪细胞衰老促进乳腺癌细胞的迁移与侵袭

目的目前化疗药物致细胞衰老的研究鲜有关注终末分化细胞,脂肪组织在乳房中占比很高,且肥胖与乳腺癌的发病密切相关。文章旨在探讨一种潜在的新型化疗药物MLN4924是否导致成熟脂肪细胞的衰老及衰老的脂肪细胞对乳腺癌细胞的影响。方法将分化成熟的脂肪细胞分为4个组,3天对照组(DMSO处理72 h),3天Mln组(Mln4924处理72 h),6天对照组(DMSO处理72 h,无药培养基中继续维持72 h),6天Mln组(Mln4924处理72 h,无药培养基中继续维持72 h)。用衰老相关标记物β-衰老半乳糖苷酶(SA-β-gal)、p53、p21、p16、Rb检测脂肪细胞的衰老;采用qPCR和ELISA检测炎症相关因子的表达与分泌;将乳腺癌细胞分为对照组和Mln组,用收集的脂肪细胞条件培养基培养乳腺癌细胞48 h,使用CCK8试剂检测乳腺癌细胞的增殖,Transwell小室法检测乳腺癌细胞的迁移与侵袭,Western blot检测处理后乳腺癌细胞上皮-间充质转换(EMT)相关蛋白的表达。结果6天Mln组中被染成绿色的脂肪细胞SA-β-gal阳性细胞率(11.71%)明显多于6天对照组(2.98%),差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot的结果显示,Mln组较对照组脂肪细胞中p53、p21蛋白的表达明显增加(P<0.01),p16的表达降低(P<0.01)。3天Mln组和6天Mln组炎症因子IL-6、TGF-β、TNF-α、CCL2及基质金属蛋白酶MMP1、MMP2 mRNA水平皆较其对照组上调(P<0.05)。ELISA结果也显示,3天Mln组IL-6(200.41±13.60)、TGF-β(76.29±4.18)均超过3天对照组(130.56±14.70)、(58.45±2.93),差异有统计学意义(P<0.05),6天Mln组IL-6(179.13±4.94)、TGF-β(125.24±0.09)均超过6天对照组(120.27±31.64)、(32.00±14.76),差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell迁移和侵袭实验结果显示Mln组被结晶紫染成紫色的细胞数量明显高于对照组,即Mln组穿过膜的MDA-MB-231细胞更多。在衰老的脂肪细胞中,观察到6天Mln组较6天对照组MMP2和MMP9蛋白表达的显著升高(P<0.01)。在条件培养基培养48 h后的MDA-MB-231细胞中,观察到Mln组的E-cadherin较对照组明显下调(P<0.01),而Vimentin和Fibronectin上调(P<0.01)。结论MLN4924处理导致成熟脂肪细胞衰老;衰老的脂肪细胞分泌炎症因子并促进人乳腺癌细胞的迁移与侵袭。

类泛素化修饰Neddylation及MLN4924抗肿瘤作用研究进展

Neddylation修饰是近年来发现的新型蛋白质翻译后修饰,可以广泛地调节生物学过程,如细胞周期、信号传导和免疫识别等。Neddylation修饰在多种肿瘤细胞中过度活化并促进肿瘤的发生、发展,如阻断此修饰通路具有显著的抗肿瘤效果。Neddylation修饰的小分子抑制剂MLN4924可使肿瘤细胞发生细胞周期阻滞、衰老和凋亡,同时还有抑制肿瘤血管生成等作用。文章对Neddylation修饰及其抑制剂MLN4924的抗肿瘤机制作一综述。

MLN4924对索拉非尼耐药肝细胞癌细胞中neddylation修饰的抑制作用

目的 索拉非尼是美国FDA于2007年批准的治疗肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的一线小分子抑制剂。然而,其在HCC患者中的反应率不高。本研究旨在进一步了解索拉非尼在HCC治疗中的作用机理,为HCC靶向治疗方法的优化提供理论基础。方法 使用蛋白印迹方法检测经索拉非尼治疗前后HCC细胞中与neddylation修饰相关蛋白的表达水平。通过CCK实验检测HCC细胞的增殖速率。结果 本研究发现索拉非尼能激活neddylation修饰相关的蛋白的表达。神经前体细胞表达的发育性下调蛋白8(neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein8,NEDD8)激活酶抑制剂MLN4924通过抑制neddylation修饰来抑制索拉非尼耐药细胞的增殖。结论 索拉非尼能引起neddylation通路的活化。泛素激活酶NAE抑制剂可以进一步抑制对索拉非尼耐药的HCC细胞的增殖。

MLN4924通过抑制类泛素化通路上调人肺腺癌A549细胞中PD-L1的表达

目的:探究MLN4924对肺腺癌A549细胞中程序性死亡-配体1(PD-L1)表达的影响及其可能的内在机制。方法:体外培养A549细胞,按(0、0.25、0.5、0.75、1、5、10μmol/L)MLN4924分组分别处理24、48、72 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,作图并计算各组半数抑制浓度(IC_(50)),流式细胞术检测PD-L1的表达,选择最适时间72 h及其IC_(50)用于后续实验。后续实验按(0、0.469μmol/L)MLN4924分组培养72 h,Western blot法检测FBXW2蛋白、肌段同源盒2(MSX2)蛋白、Y-染色体性别决定基因盒2(SOX2)蛋白、PD-L1蛋白表达,qPCR法测定PD-L1 mRNA表达。结果:MLN4924在24、48、72 h的IC_(50)值分别为(1.976、0.647、0.469)μmol/L;与对照组相比,实验组A549细胞PD-L1表达均上调,呈时间-浓度依赖性。与对照组相比,实验组A549细胞FBXW2、SOX2蛋白表达降低,MSX2蛋白、PD-L1 mRNA及蛋白表达均增加。结论:MLN4924通过抑制类泛素化通路上调人肺腺癌A549细胞中PD-L1表达。

MLN4924在病人乳腺癌小鼠移植瘤模型BR-05-0028中的药效学研究

为探讨MLN4924联合X射线放疗对人乳腺癌小鼠移植瘤模型BR-05-0028的治疗作用,采用病人来源的乳腺癌组织构建动物肿瘤模型,观察了MLN4924治疗对肿瘤细胞生长的影响。结果表明,MLN4924联合X射线放疗能够明显抑制BR-05-0028细胞的增殖。H.E染色结果显示,MLN4924联合放疗对肿瘤组织坏死较少。

MLN4924诱导胃癌细胞MGC-803发生线粒体自噬及细胞凋亡的初步研究

目的研究MLN4924是否可以诱导胃癌细胞发生线粒体自噬及细胞凋亡。方法采用MTT法检测MLN4924对胃癌细胞MGC-803增殖的影响。采用流式细胞术检测MLN4924诱导MGC-803发生细胞凋亡的情况。采用定量聚合酶链反应(qPCR)及蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测线粒体自噬相关通路的重要基因的转录及蛋白表达情况。构建自噬LC3B双标慢病毒稳转MGC-803细胞系,观察线粒体自噬的产生。结果MLN4924可显著抑制胃癌细胞MGC-803的增殖,并呈明显的剂量效应关系。MLN4924处理24 h后,可诱导MGC-803细胞发生凋亡,并且线粒体自噬相关通路的关键基因LC3B、p62及PINK1的mRNA和蛋白水平也明显升高。用MLN4924处理LC3B双标慢病毒稳转细胞模型后,可发现线粒体自噬现象。结论MLN4924可诱导MGC-803细胞发生线粒体自噬及细胞凋亡。