限制性内切酶MluⅠ基因的合成、克隆和初步表达

在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表达载体PUC19上,重组表达载体构成PUC19-M.MluⅠ.测序结果显示,载体构建成功后利用体外重组转化技术,将pet30a-MluⅠ和PUC19-M.MluⅠ转入T7expression E.coli表达菌株中.重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现限制性内切酶MluⅠ成功表达.该酶的成功表达不仅为后续研究提供了材料,而且为实验室制备限制性内切酶在方法上开辟了新的途径,为更多新发现的内切酶基因的成功克隆提供了参考.

限制性内切酶Mlu Ⅰ蛋白及其硒代衍生物的制备

【背景】限制性内切酶Mlu Ⅰ是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu Ⅰ蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组Mlu Ⅰ蛋白和硒代Mlu Ⅰ蛋白。对蛋白进行质谱检测、圆二色谱检测以及酶活检测,利用坐滴法进行结晶条件的筛选。【结果】构建了重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ并纯化获得达到结晶纯度的蛋白,通过质谱检测确定硒代Mlu Ⅰ蛋白中的8个甲硫氨酸全部被取代,结合酶活测试及圆二色谱检测确定了硒代对Mlu Ⅰ蛋白的活性、结构无明显影响。采用坐滴法进行初步的晶体生长研究,重组蛋白目前已在1种条件下获得针状晶体并进行初步衍射,获得分辨率在0.32 nm左右的衍射数据。【结论】Mlu Ⅰ蛋白及硒代Mlu Ⅰ蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究,可为下一步解析Mlu Ⅰ三维结构、作用机制的探讨及定向改造奠定基础。