Mm.158494基因在白消安引起的无精子症小鼠中的表达

目的建立一个小鼠无精子症模型,并探讨Mm.158494基因在无精子症中的表达及意义。方法建立无精子症小鼠模型,观察小鼠睾丸生精小管结构的变化。筛选与精子发生相关的睾丸特异性新基因,利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析,RT-PCR分析该基因在无精子症小鼠睾丸中的表达。结果生物信息学分析发现Mm.158494基因cDNA序列全长1046bp,含有762bp的完整开放阅读框。编码253个氨基酸、分子量为29.432kDa的蛋白质。小鼠无精子症模型中微弱表达Mm.158494基因。结论Mm.158494基因在无精子症中表达明显降低,提示该基因可能在精子发生中起重要作用。

犬贾第虫MM/Sac-C/1基因的克隆及序列分析

利用PCR技术从犬贾第虫滋养中扩增出了2004bp大小的MM/Sac-C/1基因,构建了p MD-MM/Sac-C/1克隆载体,并进行了序列测定,利用计算机对该序列进行了核苷酸同源性比较.结果表明,与GeneBank登陆的蓝氏贾第虫WB株AF236019序列比较,其同源性为98%,蛋白质同源性比较结果显示,与蓝氏贾第虫WB株表面抗原的同源性为90%,获得了犬贾第虫MM/Sac-C/1基因.

慢病毒介导shRNA干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖作用的研究

目的:探讨干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法:设计4对针对ADAM10 mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒p LVshRNA-EGFP(2A)Puro中去,构建sh/ADAM10-1,sh/ADAM10-2,sh/ADAM10-3,sh/ADAM10-4和sh/Con;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MM.1S细胞,流式细胞术分选GFP+细胞。利用实时定量PCR及Westem blot检测慢病毒载体介导的shRNA干扰ADAM10基因的作用。选取ADAM10下调最显著的细胞株,CCK-8法检测干扰ADAM10后细胞的增殖,Annexin V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞存活与凋亡,定量PCR检测促凋亡基因BAD、BAK、BIK抑凋亡基因BCL-2、c-Myc以及Notch1及其下游靶基因Hes-1的转录变化。结果:成功构建了特异性干扰ADAM10表达的慢病毒载体,干扰ADAM10基因对MM.1S细胞的增殖具有抑制作用,并能诱导MM.1S细胞的凋亡,且促凋亡基因BAD、BAK表达升高,抑凋亡基因BCL-2、c-Myc表达降低。Q-PCR结果显示,干扰ADAM10后Notch1水平升高,Hes-1水平降低。结论:干扰ADAM10基因可显著抑制MM.1S细胞的增殖,促进其凋亡,其机制与Notch1信号通路有关。

ScFv(3G11)-mms13融合基因克隆及表达载体构建

目的通过重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术克隆融合基因ScFv(3G11)-mms13并构建融合蛋白表达载体pET30a(+)-ScFv(3G11)-mms13,为重组制备肿瘤靶向细菌磁小体提供转基因载体。方法根据mms13基因和ScFv(3G11)基因的序列,设计以PCR引物,以克隆载体pMD18-mms13和pMD18-ScFv为模板,采用SOE-PCR技术构建融合基因ScFv-Linker-mms13。进而将融合基因ScFv-mms13与pET30a(+)连接构建重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,测序后应用软件DNAMAN进行分析。结果应用重叠延伸拼接PCR方法构建融合基因ScFv-linker-mms13(1158bp),然后通过克隆技术得到重组质粒pMD18-ScFvmms13。将融合基因ScFv-Linker-mms13插入到pET30a(+)构建了重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13;菌落PCR、酶切、DNA测序鉴定结果均表明目的片段准确地插入到表达载体中。结论通过SOE-PCR技术扩增了预先设计的长达1158bp的融合基因片段ScFv-Linker-mms13,并成功构建了重组质粒pMD18-ScFv-mms13及重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,为磁小体用于肿瘤靶向治疗研究提供了实验材料。

用注射型与口服型MM—基因工程菌苗预防仔猪黄白痢病对比试验

由北京军事医学科学院生物工程研究所研制并获农业部兽医生物制品规程委员会评审批准持新兽药证号(一类)MM活菌苗,已成为我国第一个获得批准的兽用基因工程菌苗.全国近20个省市不同条件和类型的养猪场、户先后使用,对新生仔猪黄白痢病的保护率在90%以上,安全性好.鉴于该苗有两种剂型,笔者曾做了有关试验,现将结果报告如下:

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(FK)基因, 构建真核表达质粒, 并在小鼠肝癌细胞中表达, 用以进行肿瘤的基因治疗, 用RT PCR法, 从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA, 插入pCR2. 1 TOPO载体, 测序证实后,将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体; 用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45T Li细胞, 经G418筛选获得抗性细胞克隆, 用RT PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中 FK基因的表达. 结果表明: 经限制性内切酶酶切图谱分析和 DNA 序列测定证实目的基因已插入重组质粒, RT PCR 和免疫化学方法证明转基因MM45T .Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达.

MALT1-A20-NF-κB信号分子在MM中的表达特点

目的:了解多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中黏膜相关组织淋巴瘤异位基因1(MALT1)、A20与核转录因子κB(NF-κB)基因的表达特点。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR和相对定量分析法检测20例MM患者(Ⅰ期7例,Ⅱ期3例,Ⅲ期10例)及21例健康人外周血单个核细胞(PBMC)中MALT1、A20和NF-κB基因的表达情况。以β2微球蛋白基因(β2m)作为内参;采用相对定量公式:α^(-△Ct)×100%,分别计算MALT1、A20和NF-κB基因的表达水平。结果:MM患者PBMC中的MALT1和A20基因的表达水平较健康人都有明显的降低(P=0.000),而MM中NF-κB基因的表达水平较正常人有所升高,但无统计学差异(P>0.05)。在健康人组,MALT1和NF-κB的表达水平呈现正相关(P=0.001,r=0.666),而在MM组,MALT1、A20与NF-κB 3种基因均不存在明显相关性。同时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期MM患者MALT1基因的表达量较健康人明显降低(P<0.05),A20基因的表达量较健康人明显降低(P<0.01),而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期MM患者MALT1、A20和NF-κB之间的表达情况均无统计学差异。结论:当MALT1-A20介导的细胞免疫和炎症的信号通路发生异常改变时,可能与MM的发生发展有着密切关系。

视神经病变诱导反应蛋白在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义

目的研究视神经病变诱导反应蛋白(optineurin,OPTN)基因在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中的表达情况,探讨OPTN基因参与MM发生发展的机制和临床价值。方法利用3个基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)数据集(GSE6477、GSE136324和GSE24080),分析OPTN在MM中的表达;通过收集MM患者临床骨髓标本,利用qRT-PCR实验进一步验证OPTN在MM患者中的表达情况。使用Kaplan-Meier生存曲线、受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析OPTN在MM预后和诊断中的价值。同时利用癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载MM转录组数据,根据OPTN mRNA表达水平中位数界,将MM患者分为OPTN高、低表达组,用R语言limma包筛选差异表达基因后,对差异基因进行富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)从而挖掘OPTN在MM中的潜在临床意义及其可能参与的分子机制。结果OPTN在MM组织中表达显著低于正常组织(P<0.05);OPTN表达变化与MM患者的国际分期体系(International Staging System,ISS)显著相关(P<0.05);ROC结果显示OPTN表达变化可区分正常人和MM患者。生存分析显示OPTN低表达患者总生存率(overall survival,OS)显著低于高表达患者(P<0.05)。GO、KEGG和GSEA富集分析结果表明,OPTN可能通过调控NOD样受体、NF-κB、TNF及RAS/MAPK等通路进而影响细胞凋亡、自噬及调节细胞免疫反应等参与MM的进程。结论OPTN在多发性骨髓瘤中低表达,与患者预后不良相关,可能作为MM诊断及治疗的重要潜在生物标志物。

金华猪肌细胞生成素基因的初步研究

运用PCR-RFLP方法对金华猪I系(178头)、II系(30头)、III系(41头)的肌细胞生成素(MyoG)基因的第2内含子内(PCR1-MspⅠ-RFLP)和3'端(PCR2-MspⅠ-RFLP)位点进行多态性分析。结果表明,PCR1-MspⅠ-RFLP位点有3种基因型,即AA型、AB型和BB型,其基因型频率分别为0.1544、0.3826、0.4631;PCR2-MspⅠ-RFLP位点只有2种基因型,MM型和MN型,其基因型频率分别为0.9953和0.0047。

恶性黑色素瘤基因治疗的研究进展

恶性黑色素瘤 (MM )多发生在成人 ,是一种恶性程度很高的恶性肿瘤。对放疗、化疗不敏感 ,且其疗效持续时间短 ,临床治疗很棘手。基因治疗给MM病人带来了希望 ,人们把MM选择为第一个基因治疗临床试用的目标。在短短 10年内 ,MM的基因治疗已取得了长足的进展 ,按所用的基因可分为免疫基因治疗、反义核酸与抗癌基因治疗、自杀基因治疗及联合基因治疗。本文就近几年来这几方面的研究进展作一个综述。

工程菌E.coli MM2的固定化细胞制备

固定化细胞技术是七十年代兴起的一门应用技术。固定化细胞具有细胞密度高、易进行连续生产且稀释率高、不易被污染、产物易分离、可降低设备规模等优点,已成为生物合成、生物转化的有效工具,得到广泛应用。近十年来,人们把固定化细胞技术应用到工程菌的培养中取得了一些有价值的结果。用工程菌制得的固定化细胞裂解青霉素生产6-APA,已达工业化生产水平。据文献报道,工程菌固定化后可大大提高重组质粒的稳定性,并且外源基因能稳定地表达。

婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

旨在建立针对阪崎肠杆菌的双重荧光PCR快速检测方法。以阪崎肠杆菌局部大分子合成(MMS)操纵子和外膜蛋白A(ompA)为靶基因,建立双重荧光 PCR 反应体系,探讨该体系的特异性、灵敏度和抗干扰能力。结果表明,双重荧光 PCR 体系对阪崎肠杆菌的灵敏度为4.3×10~3CFU/mL,人工污染初始菌量为2 CFU/100 g奶粉样品增菌24 h即可检出;39株实验菌中的15株阪崎肠杆菌出现特异性扩增,24株非阪崎肠杆菌未出现特异性扩增。本研究所建立的双重荧光PCR体系特异好、灵敏度较高及抗干扰能力强,可用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测。

雷舒宁(黏质沙雷菌苗)抗肿瘤转移的实验研究

目的 探讨雷舒宁 (黏质沙雷菌苗 )抑制脾脏接种的小鼠肝癌HCA肝转移的作用及其分子机制。方法 腹腔注射雷舒宁 ( 6mg/kg、4mg/kg、2mg/kg 3个剂量组 ) ,连续隔日给药 6次 ,计算小鼠生命延长率。采用定量逆转录 -聚合酶链反应技术(RT -PCR )检测实验组和对照组nm 2 3基因、Tiam -1基因的表达。结果 雷舒宁可明显延长肝癌小鼠的生存期 ,3个剂量组的延长率分别为 5 5 .8%± 1.3% ,49.2 %± 1.6%、43.2 %± 1.7% ,具有明显的剂量 -效应关系 (P <0 .0 5 )。肿瘤原发灶nm 2 3-1、Tiam -1基因的表达水平明显高于癌旁正常组织 ,雷舒宁能明显抑制侵袭诱导基因Tiam -1和nm 2 3-1的表达。对肿瘤原发灶和转移灶nm 2 3-1基因抑制率分别为 5 5 .6%、5 7.8%。对肿瘤原发灶和转移灶Tiam -1基因抑制率分别为 34 .8%、36.7%。结论腹腔注射黏质沙雷氏菌苗可明显抑制小鼠肝癌HCA肿瘤转移相关基因nm 2 3-1和Tiam

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因方法的建立

目的建立克罗诺杆菌的特异、灵敏的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank公布的克罗诺杆菌MMS基因高保守序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化反应体系,用25种其他常见致病菌评价反应体系的特异性,用克罗诺杆菌MMS基因重组质粒构建实时荧光定量PCR标准曲线,对重组质粒、纯菌和人工模拟污染样本进行灵敏度试验,并与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR比较,配对t检验分析两种方法对Ct值和荧光强度的差异。结果采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因仅需40 min,与25种非目标菌无交叉反应,仅对克罗诺杆菌有特异性扩增;所构建方法线性关系良好,相关系数r2=0.999,扩增效率为99.972%,对重组质粒、纯菌、人工模拟污染样品标本的灵敏度分别达10拷贝/反应、3.8和38 cfu/ml;与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR相比,TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR的Ct值更小、△Rn值更高,灵敏度和分辨率差异均有统计学意义(Ct:t=-14.406,P﹤0.01;△Rn:t=14.230,P﹤0.01)。结论本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR反应体系能够快速、特异、灵敏地检测克罗诺杆菌MMS基因,可用于婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的快速筛查和鉴定,具有较大的的应用价值和推广价值。

血管内皮生长因子在多发性骨髓瘤骨髓组织中的表达及其意义

目的 :检测多发性骨髓瘤 (MM )骨髓活检塑料包埋切片中血管内皮生长因子 (VEGF)的表达情况 ,探讨VEGF在MM发病机制中的作用。方法 :对 2 0例初诊的MM患者和 10例正常对照者进行骨髓活检 ,制成塑料包埋切片 ,应用免疫组织化学SP染色法检测骨髓组织中VEGF表达情况和微血管密度 (MVD) ,进行分析研究。结果 :2 0例初诊MM患者骨髓中MVD及VEGF表达阳性率高于对照组 ,VEGF和MVD呈正相关。结论 :VEGF和MM的血管生成密切相关 ;VEGF在MM发病机制中起着重要作用 ;抑制VEGF的分泌将有可能成为一种新的治疗MM的有效方法。

DNA甲基化与多发性骨髓瘤

DNA甲基化是目前肿瘤领域研究中研究最多的表观遗传学机制之一.主要发生在DNA的CpG岛.DNA的甲基化通过甲基转移酶(DNA methyltransfeases,DNMTs)完成.DNA甲基化在多种肿瘤的发生、发展中都起到了重要的作用.大量研究发现,甲基化与多发性骨髓瘤的发生、发展及诊断治疗等有密切关系.深入探讨多发性骨髓瘤(MM)相关的甲基化可为MM发病机制的研究及治疗提供新的思路.

三氧化二砷改变多发性骨髓瘤细胞基因表达的研究

目的 研究三氧化二砷(As2O3 )对多发性骨髓瘤(MM)细胞基因表达的影响,探讨As2O3 治疗MM的分子机制。方法 将MMU266细胞分成对照组和实验组。取培养48h的2组细胞提取总RNA后分离mRNA,应用抑制性差减杂交法分离差异表达基因,并连接于pGEM TEasyVector,转化大肠杆菌JM109,构成差减cDNA文库,经蓝白斑筛选后挑选白色菌落,提取质粒,序列测定后进行同源性比较分析。结果 第1次差减分离出5个下调的基因:①氨基肽酶N;②人类肿瘤翻译控制蛋白1;③人类ATP合成酶A链;④信号识别颗粒A10; ⑤线粒体ATP合成酶/ATP酶亚单位6。第2次差减分离出4个表达上调的基因:①钙结合蛋白A10;②角质素6A;③相对分子质量为45×103 的含MIP重复成分的剪接因子;④多聚腺苷酸结合蛋白。结论 As2O3 可能通过改变上述基因的表达,发挥其抑制MM细胞增殖、促进凋亡和诱导分化的作用。

多发性骨髓瘤患者p16基因甲基化及砷剂诱导去甲基化的研究

目的探讨p16基因启动子区CpG岛甲基化在多发性骨髓瘤(MM)患者发病中的作用以及三氧化二砷(As2O3)诱导p16基因的去甲基化作用。方法采用巢式甲基特异性PCR法检测MM患者以及利用As2O3作用前后人MM细胞株U266的p16基因的甲基化状态,RTPCR检测U266细胞用药前后p16基因mRNA的表达变化,生长曲线、MTT法检测As2O3对细胞的生长和增殖抑制。利用流式细胞仪检测DNA含量分析法探讨As2O3对骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果MM患者p16基因的甲基化比例为54.8%,U266细胞存在p16基因甲基化,p16基因不表达,As2O3作用后p16基因甲基化程度明显减弱至消失,与未处理组相比,不同剂量作用72h后p16基因表达阳性条带灰度值与βactin比值分别为0.22±0.10、0.59±0.11、0.68±0.09,阳性对照灰度比值为0.77±0.13,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论p16基因甲基化在MM患者中较为常见,这可能为MM的诊断和治疗提供借鉴;As2O3可诱导p16基因去甲基化,使p16基因表达上调,恢复其活性,为去甲基化治疗提供新思路。

LC-MS法同时检测甲磺酸伊马替尼中3个磺酸酯基因毒杂质

目的：建立LC-MS法对甲磺酸伊马替尼原料中的3个磺酸酯基因毒杂质—甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、甲磺酸异丙酯（IPMS）进行定量检测。方法：选用Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱（2.7μm,4.6 mm×100 mm）,以10mmol·L^-1甲酸铵（含0.1%甲酸）为流动相A,甲醇为流动相B,梯度洗脱[0 min（80%A-20%B）→5 min（10%A-90%B）→10 min（10%A-90%B）→10.5 min（80%A-20%B）→18.5 min（80%A-20%B）],流速为0.4 m L·min^-1。ESI正离子化SIM模式下对3种磺酸酯进行同时检测,雾化氮气压力0.3 MPa、温度300℃、流速10 L·min^-1,毛细管电压3 k V,传输电压30 V。结果：MMS在10-100 ng·m L^-1内线性关系良好（r=0.9988）,定量限为10 ng·m L^-1;EMS在5-50 ng·m L^-1内线性关系良好（r=0.9992）,定量限为5 ng·m L^-1;IPMS在10-100 ng·m L^-1内线性关系良好（r=0.9993）,定量限为10 ng·m L^-1。MMS、EMS、IPMS的回收率分别为99.86%、101.7%、103.8%。结论：经方法学验证,该法可用于甲磺酸伊马替尼中3个磺酸酯基因毒杂质的同时检测,能为质量控制提供参考。