结核分枝杆菌MmpL5蛋白与贝达喹啉及氯法齐明相互作用的关键结合区域研究

目的 表达纯化结核分枝杆菌MmpL5蛋白,从而进一步检测MmpL5蛋白与药物之间的相互作用,探究MmpL5外排系统所导致的耐药机制。方法 通过分子对接技术预测MmpL5蛋白与药物结合位点。基于分子对接结果,以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,构建MmpL5-L1截短蛋白的表达质粒,并在大肠埃希菌中进行表达纯化。利用荧光淬灭技术和表面等离子体共振技术检测截短蛋白与药物之间的相互作用。结果 成功在大肠埃希菌中表达纯化结核分枝杆菌膜截短蛋白MmpL5-L1(Q52-R202),MmpL5-L1截短蛋白与氯法齐明相互作用使蛋白产生荧光淬灭,表面等离子体共振实验表明MmpL5-L1截短蛋白与贝达喹啉的亲和常数(KD)为4.033×10~(-5) mol/L,与氯法齐明的亲和常数(KD)为1.218×10~(-5) mol/L。结论 本文预测并确证了结核分枝杆菌MmpL5蛋白与贝达喹啉、氯法齐明结合的关键结合氨基酸区域,为贝达喹啉、氯法齐明与MmpL5蛋白结合进而通过MmpS5-MmpL5外排提供了直接证据,对进一步阐明贝达喹啉耐药以及氯法齐明交叉耐药机制奠定了一定基础。

结核分枝杆菌膜蛋白MmpS5-MmpL5的表达及功能研究

目的:表达结核分枝杆菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5外排泵系统,探讨其在贝达喹啉耐药中的作用。方法:构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5的乙酰胺诱导型表达载体,在耻垢分枝杆菌中诱导表达MmpL5蛋白及MmpS5-MmpL5蛋白,测定表达菌株的生长特性及其外排能力,同时探讨贝达喹啉对表达菌株最小抑菌浓度的变化与对菌体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量的影响。结果:成功在耻垢分枝杆菌中表达结核分枝杆菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5,表达菌株的生长不受影响,共表达MmpS5-MmpL5蛋白的菌株外排能力增加,导致其对溴化乙锭的积累量(△荧光强度为395)较表达MmpL5蛋白组(△荧光强度为655)和携带pMV261s空质粒组(△荧光强度为642)减少约40%。贝达喹啉对MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度由0.25μg/ml提高到2μg/ml,增加了8倍。贝达喹啉将MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝杆菌菌体内ATP含量[(0.197±0.018)μmol/L]降低36.49%[(0.125±0.010)μmol/L]。MmpL5单表达不能形成外排泵,也对贝达喹啉无影响。结论:结核分枝杆菌的膜蛋白MmpL5和MmpS5需要共表达才能在耻垢分枝杆菌中发挥作用,降低贝达喹啉的药物敏感性。MmpS5-MmpL5蛋白表达体系的建立为进行贝达喹啉的具体转运机制研究奠定了基础。