日本沼虾表皮酚氧化酶原激活因子基因的克隆及功能

为了探索表皮酚氧化酶原激活因子(prophenoloxiase activating factors,PPAFs)在甲壳动物免疫反应中的功能,基于前期转录组数据,本实验利用PCR和RACE技术从日本沼虾表皮克隆并鉴定了一个新的PPAF基因,命名为MnPPAF1 (GenBank登录号为OP784577),利用生物信息学、实时荧光定量PCR (qPCR)和RNA干扰(RNAi)等方法,研究了该基因序列特征、时空表达模式、嗜水气单胞菌攻毒后表皮MnPPAF1的转录水平、酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性以及日本沼虾死亡率的变化。结果显示,MnPPAF1 cDNA全长1 718 bp,编码460个氨基酸,具有夹子结构域丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteinases,Clip-SPs)和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine proteases,Tryp-SPs)结构域。MnPPAF1在腹背部的表皮、血细胞、鳃、胃、心脏、肝胰腺等多种组织均有表达;表皮MnPPAF1的表达与蜕皮周期有关,与蜕皮间期(C期)相比,蜕皮前晚期(D4期) MnPPAF1表达量增加857%。嗜水气单胞菌攻毒后,表皮MnPPAF1表达水平在6 h达到了峰值,较对照组增加227%,而表皮PO活性在12 h达到峰值,同比增加24%。在腹背部第2节注射3μg dsRNA溶液,每12小时注射1次,共注射3次,最后1次注射后12 h,干扰效率最高,表皮MnPPAF1表达同比下降71.79%,至24 h,表皮PO活性降低72.31%。在干扰效率最高的时间点攻毒,在120 h,攻毒+干扰组虾的累计死亡率比攻毒+未干扰组增加26%。结果表明,MnPPAF1是表皮重要的免疫因子,参与调节酚氧化酶原系统的激活,该基因表达下调能显著增加嗜水气单胞菌感染虾的死亡率。本研究为阐明表皮在甲壳动物免疫系统中的作用积累了资料。