柽柳(Tamarix androssowii)Tadir基因的克隆及分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了Tadir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长724bp。其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸。基因编码蛋白的分子量为19.69kD,理论等电点为6.96。疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的。该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因),ABE73781(蛋白)。实时荧光定量PCR分析结果表明,0.4mol·L-1NaCl和NaHCO3胁迫后该基因表达量发生变化,其可能与柽柳的耐盐性有关。

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列。该基因全长为1087bp。其中,5'非编码区40bp,3'非编码区333bp,开放读码框(ORF)长699bp,编码232个氨基酸。分子量为26KD,等电点为7.10。该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高。该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白)。将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中。对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1(pYES2)进行干旱、高温胁迫实验。结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力。

柽柳MnSOD基因(英文)

在环境胁迫下,植物体内活性氧(ROS)的大量积累会对其本身产生毒害作用。SOD酶在清除这些活性氧化酶机制中发挥关键作用。大量研究表明,MnSOD可有效增强转基因植物抵抗氧化胁迫的能力。我们从抗逆性较强的木本植物紫杆柽柳中克隆到一个新的MnSOD基因,并将该全长基因在GenBank上注册,其登录号分别为AY573576(基因序列)和AAS77885(氨基酸序列)。这将为研究木本植物的抗逆机理和该酶在抗逆基因工程中的应用奠定基础。

基因芯片技术研究柽柳NaHCO_3胁迫下基因的表达

运用基因芯片技术研究了NaHCO3胁迫下柽柳 (Tamarixandrossowii)基因的表达。将Cy5和Cy3两种荧光染料分别标记在NaHCO3处理和对照的柽柳cDNA上 ,将两种荧光探针混合 ,与载有柽柳基因的高密度芯片进行杂交并用芯片扫描系统进行扫描 ,通过Cy5与Cy3信号强度比值的计算研究基因的差异表达。共获得了 89个差异表达的基因 ,其中 ,2 7个下调表达 ,6 2个上调表达。BlastX分析表明这些基因按功能可以分为光合作用、活性氧清除、渗透调节、信号传导与表达调控、代谢、发育相关、核糖体蛋白、蛋白质的分解与再生、转运类蛋白、水通道蛋白等几大类别。同时 ,发现了一些与盐胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因 ,这些基因可能在柽柳抗盐过程中具有重要作用。揭示了柽柳的抗盐胁迫涉及的几种重要途径 ,并获得了NaHCO3胁迫前后柽柳基因表达谱。

紫杆柽柳cDNA文库构建与硫氧还蛋白基因的克隆

以NaHCO3胁迫的紫杆柽柳(Tamarix androssowii)为材料建立了cDNA文库.经检测,文库的初始滴度为5.7×105pfu,重组率为96%,插入片段的长度在0.3～3.0kb之间,平均长度为1.2kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu/ml.对文库克隆进行随机测序,获得了紫杆柽柳的硫氧还蛋白(Thioredoxin)基因序列.生物信息学分析表明获得的硫氧还蛋白基因全长683bp,其中5'非翻译区长56bp,3'非翻译区长204bp,开放读码框长423bp,编码140个氨基酸,蛋白的分子量为15.1kD,理论等电点为5.59,其氨基酸序列中具有硫氧还蛋白的保守活性位点'WCGPC'序列,Clustal分析表明该硫氧还蛋白与蓖麻(Ricinus communis)的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性高,达65%.本研究构建的cDNA文库为柽柳基因克隆和系统研究柽柳抗逆分子机理奠定了基础.

cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下柽柳基因的表达

运用cDNA微阵列技术研究干旱胁迫下柽柳(Tamarix androssowii)基因的表达。分别将Cy5和Cy3两种荧光染料标记在干旱处理和对照的柽柳cDNA上,并与载有柽柳基因的微阵列进行杂交,通过计算机对芯片进行扫描和分析研究干旱胁迫下基因的表达。共获得了47个下调表达和62个上调表达的基因。Blastx分析表明这些基因按功能可以分为脱水保护、信号传导与调控、活性氧清除、光合作用、代谢、核糖体蛋白、蛋白质的分解与再生等几大类别。同时,发现了一些与干旱胁迫相关的功能未知基因和新基因。从而揭示了柽柳具有活性氧消除、代谢调节、脱水保护、蛋白质降解与再生等抗旱途径,并阐述了干旱胁迫前后柽柳基因的差异表达。

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

用木麻黄(Casuarina glauca)的金属硫蛋白基因(metallothionein 1)氨基酸序列对柽柳ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了柽柳金属硫蛋白基因全长cDNA序列,去除polyA后该基因全长366 bp,其中5′非翻译区97 bp,3′非翻译区59 bp,开放读码框(ORF)长210 bp,编码70个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为6.793 kD,理论等电点为4.99,含10个Cys,集中分布在肽链的N端和C端。Blast P同源性分析表明该基因与花生同源性最高,与小豆同源性最低。该基因的EST序列在GenBank登录(登录号:CV792539)。

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及分析

应用生物信息学技术从柽柳cDNA文库中分离出了一种金属硫蛋白全长cDNA序列,去除PolyA后该基因全长517bp。其中,5′非翻译区31bp,3′非翻译区267bp,开放读码框(ORF)长219bp,编码72个氨基酸,含13个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CXC形式排列,基因编码蛋白的分子量为7.1kD,等电点为4.71。疏水性分析表明,蛋白的30～50个氨基酸之间有较强的疏水性,经过Pfam15.0(St.Louis(USA))分析证明,为金属硫蛋白家族基因。金属硫蛋白基因参与了植物的发育、胚胎发生、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能基因。此基因的Genbank登录号为AY620987(基因),AAT39518(蛋白)。

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列。基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9kD,等电点为8.02。此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因。其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白)。

柽柳eIF1A基因耐重金属CdCl_2胁迫能力分析

通过实时荧光RT-PCR技术研究了CdCl2胁迫下不同时间点柽柳根、茎、叶中eIF1A基因的表达模式,结果表明:该基因受CdCl2胁迫诱导明显,可能参与柽柳的CdCl2胁迫应答。进一步对转柽柳eIF1A基因的T2代烟草进行CdCl2胁迫,测定各转基因株系及野生型烟草的MDA、POD、SOD、可溶性蛋白含量等各项抗逆生理指标,结果表明柽柳eIF1A基因具有提高烟草的耐CdCl2胁迫的能力。

白花柽柳质膜水孔蛋白基因克隆及序列分析

植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道,在植物种子萌发、细胞伸长、气孔运动、受精等过程中调节水分的快速跨膜运输。有的水孔蛋白还在干旱胁迫应答中起重要作用。本文根据白花柽柳的PEG6000胁迫处理构建的SSH消减文库的水孔蛋白基因表达序列标签(EST),设计基因特异性引物进行5′RACE,克隆出一个1043bp的核苷酸序列。应用生物信息学软件进行分析,预测该序列编码287个氨基酸,具有6个跨膜区,有MIP家族信号序列SGXHXN-PAVT,高等植物PIP高度保守序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN,这是质膜水孔蛋白基因的典型的结构特征。经NCBI比对,与Arabidopsis thaliana(MIP-C),同源性达到95%,预测该蛋白的相对分子量是30·9KD,理论等电点是8·84。

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).

刚毛柽柳富含甘氨酸RNA结合蛋白ThGRP1基因克隆与表达分析

在有机体的生长和发育过程中,基因表达在转录、转录后和翻译水平都受到严格地调控。转录调控是基因表达调控的第一步,曾被认为是基因表达的主要调控机制,但是随着对转录后调控机制越来越多的了解，发现转录后调控在基因表达调控中同样起着重要作用。转录后的调控决定着基因表达最终产物的种类和表达量。转录后水平的基因表达调控主要是通过RNA结合蛋白（RBPs）直接完成，或通过RBPs控制其它转录因子间接完成的。

仿刺参超氧化物歧化酶基因cDNA全序列的克隆及其特征分析

以仿刺参Apostichopus japonicus为材料,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法首次得到仿刺参MnSOD的全长cDNA。该全长cDNA大小为955bp,其中5′端非编码区67bp,3′端非编码区216bp,开放阅读框(ORF)672bp,在3′端有多聚腺苷酸信号序列ATTTA,并有polyA加尾,符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。MnSOD全长cDNA可编码223个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子质量为24.64kD,理论等电点是6.66,为亲水性蛋白。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,仅有一段线粒体导肽。其二级结构主要以α-螺旋为主,无规则卷曲和延伸链构成了蛋白中量最大的结构元件,不含β-折叠。仿刺参SOD的氨基酸序列与目前已报道的其他物种如人、牛、斑马鱼、原鸡、非洲爪蟾、中国对虾、皱纹盘鲍、海湾扇贝、果蝇等的MnSOD氨基酸序列进行序列比对的结果表明,相似性均在61%～69%之间,说明该基因在各物种间具有一定的保守性。该段氨基酸序列无N-糖基化位点,含有3个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个肉豆蔻酰基化位点,还发现了1个SOD家族的特征肽段DVWEHAYY。对磷酸化位点分析发现,有1个丝氨酸Ser,3个苏氨酸Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化位点。二硫键分析表明,SOD含有3个半胱氨酸Cys,形成1个二硫键,连接着第17位和第107位的Cys。仿刺参MnSOD全长cDNA的克隆为更好地理解生物体内防御系统的催化O2-发生歧化反应、消除活性氧、维持机体活性氧代谢的平衡提供了理论基础。

人锰超氧化物歧化酶基因的克隆及高表达

为获得高表达人锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的工程菌。从肿瘤组织中提取总RNA ,利用逆转录聚合酶链反应扩增人MnSOD的cDNA ,将克隆的基因片段插入表达载体pET2 8a(+ )内的NcoI/EcoRI位点 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,用PCR及SDS -PAGE的方法筛选高表达人MnSOD的工程菌。结果构建成功高表达人MnSOD的工程菌 ,表达的人MnSOD相对分子质量约为 2 2 0 0 0 ,表达量约占菌体蛋白的 3 0 %。为大量制备人MnSOD和进一步的应用研究奠定了基础。

刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析

[目的]研究刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析。[方法]采用染色体步移技术,克隆到刚毛柽柳ThPIP基因起始密码子上游1 241 bp启动子序列,并通过PLACE和PlantCARE预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件。将该启动子替换pCAMBIA1301上的35S启动子,构建融合表达基因proThPIP∷GUS,通过基因枪瞬时转化烟草,并进行GUS组织化学染色。[结果]该启动子具有活性,能够驱动GUS基因的表达。[结论]为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础,从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据。

茄子MnSOD基因的克隆及表达分析

以茄子品种‘禾线’为材料,采用同源克隆方法从茄子中克隆获得一个MnSOD基因,其开放阅读框全长为687 bp,编码228个氨基酸,将其命名为SmMnSOD。序列分析表明,SmMnSOD与辣椒MnSOD序列相似性达到91%,与番茄MnSOD序列相似性达到84%。预测该蛋白质分子量为25.63 k Da,蛋白等电点为8.46。亚细胞定位结果显示,MnSOD蛋白定位于线粒体。实时荧光定量PCR表明,SmMnSOD在不同组织器官中均有表达,但在叶片中表达量最多,其次为花瓣和根,果肉中最少。在Na Cl胁迫下,SmMnSOD表达量呈现先上升后下降趋势;聚乙二醇胁迫抑制了SmMnSOD的表达;外源脱落酸胁迫下,SmMnSOD的表达量是波动变化的;低温胁迫极显著地抑制了SmMnSOD的表达。实验结果证明,SmMnSOD主要在茄子叶片、花瓣和根中表达,在线粒体中发挥功效,可能与茄子抵御渗透性胁迫和干旱胁迫相关。

紫外线、高压静电和大麦黄矮病毒胁迫下荻草谷网蚜SOD基因表达

为探索环境胁迫影响昆虫适合度的内在机制,通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆得到荻草谷网蚜Sitobion miscanthi体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因MnSOD和CuZnSOD的cDNA序列全长,对该序列进行分析,检测紫外线、高压静电和大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)胁迫下荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD基因表达量的变化。结果显示,荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD基因的cDNA序列全长分别为1517 bp和954 bp(GenBank登录号分别为MT533627和MT533626),开放阅读框分别为669 bp和459 bp,分别编码222个和152个氨基酸,预测蛋白质相对分子量分别为24.99 kD和15.84 kD。荻草谷网蚜体内MnSOD和CuZnSOD蛋白均与半翅目蚜科昆虫同源蛋白氨基酸序列相似性高,亲缘关系最近。0.50 m W/cm^(2)(低强度)和0.70 m W/cm^(2)(高强度)紫外线胁迫下荻草谷网蚜体内MnSOD基因相对表达量显著上调,分别为对照的2.55倍和1.40倍,高压静电和BYDV胁迫下荻草谷网蚜体内MnSOD基因相对表达量显著下调,分别为对照的32%和14%;但低强度和高强度紫外线胁迫下荻草谷网蚜体内CuZnSOD基因相对表达量均较对照无显著变化,高压静电和BYDV胁迫下荻草谷网蚜体内CuZnSOD基因相对表达量均显著下调,分别为对照的51%和20%。表明SOD基因在荻草谷网蚜适应紫外线、高压静电和BYDV三种环境胁迫中发挥着重要作用。