胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。