新型氧化铁微粒(MIRB)标记兔骨髓间充质干细胞及其MRI体外显影研究

目的采用能被荧光显微镜检测的新型氧化铁纳米颗粒（MIRB）标记兔骨髓间充质干细胞（BMSC），研究其标记效率和对BMSC增殖活性的影响，并初步探讨标记BMSC体外MRI的可行性，为移植干细胞活体MRI提供实验基础。方法成功培养和鉴定免骨髓间充质干细胞（BMSC）后，采用铁浓度为25pgμg/mL、50μg／mL的MIRB标记BMSC，应用MTS法比较两浓度组标记BMSC和未标记BMSC增殖活性；通过观察标记细胞内荧光显影和普鲁士蓝染色评价两浓度组的标记效率，应用1．5T MR对不同数量级细胞分别T，WI和T＊WI序列扫描。结果两组标记细胞内均可见明显荧光显影，普鲁士兰染色显示两个不同铁浓度MIRB标记细胞的标记率比较差异无统计学意义（P〉0．05）；MTS检测提示两个标记细胞组和未标记细胞组的细胞增殖活性有统计学差异（P〈0．05）；对不同数量级的MIRB标记BMSC行MR．扫描，T2W1和T2＊WI能检测到的最小细胞数量级为1 x 1（一结论25μg Fe／ML和50μg Fe／mL的MIRB均能有效标记BMSC，但对BMSC的增殖活性有影响且随浓度增加而加重，因此25μg Fe／1nL是适合的标记浓度。1．5T MR可在体外检测到标记细胞信号改变，最小细胞数量级为1×10^5。

3.0 T核磁共振在大鼠体内示踪环氧化酶-2基因沉默的干细胞

目的利用临床3.0 T核磁共振成像（MRI）对通过尾静脉注射Molday ION Rhodamine-B^TM（MIRB）标记慢病毒介导环氧化酶-2（COX-2）基因沉默的人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的大鼠活体示踪。 方法利用慢病毒介导在hBMCSs中沉默COX-2基因，通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测基因表达。将转基因hBMSCs进行新型氧化铁颗粒MIRB标记，测定最佳标记浓度，通过细胞计数试剂盒（CCK-8）测定标记后细胞增殖能力，分组检测细胞成骨、成脂能力。将MIRB标记、慢病毒介导COX-2基因沉默的hBMSCs，单纯hBMSCs与磷酸盐缓冲液（PBS）分为3组，分别通过尾静脉注射的方法注射入大鼠体内。分别于注射后1 h、7 d、14 d通过临床3.0 T MRI检测大鼠脑、肝脏，检测后处死大鼠，取脑、肝脏组织石蜡切片，通过荧光显微镜观察组织内荧光，普鲁士蓝染色观察组织内铁粒子位置。 结果通过RT-PCR和Western blot证实COX-2在hBMSCs中成功敲除，与对照组比较，MIRB浓度为10 μg Fe/ml时标记率可达到90%，当浓度上升到20 μg Fe/ml时标记率可达到98%，浓度为50 μg Fe/ml时标记率与20 μg Fe/ml时比较差异无统计学意义，MIRB浓度〈50 μg Fe/ml时对转基因干细胞可成功标记并不影响其分化、增殖能力。在大鼠体内注射7 d后，通过MRI梯度回波T2加权在大鼠肝脏组织内发现低信号逃避区域，并随时间延长逐渐加强，注射14 d后低信号区域趋于稳定，通过组织切片在大鼠肝脏血管、血窦、肝小叶间和被膜中发现铁粒子的存在。 结论MIRB对转基因干细胞具有生物安全、高效标记、多重方法检测的优点。MIRB标记的慢病毒介导COX-2基因沉默的hBMSCs在注射入大鼠体14 d内，可以通过3.0 T MRI检测并且追踪。