莫那可林J的电喷雾质谱裂解规律研究(MS^1～MS^6)

采用电喷雾离子阱质谱技术,在正离子检测模式下对化合物莫那可林J的质谱裂解规律(MS1~MS6)进行研究。试验发现:该化合物由于其结构的特征,主要通过失去H2O、CH3COOH或多烯烃离子CnH2n(n=1~5)形成各碎片峰;其中通过氢迁移和逆DA反应使B、C环裂解形成众多小分子碎片(相对分子质量小于200),体现了烯烃和环烯烃的质谱裂解特征。这些规律为莫那可林J及其他他汀类化合物的构效关系研究提供了参考数据。

碳源对土曲霉中洛伐他汀生物合成的影响

通过摇瓶培养考察碳源种类及其初始水平对土曲霉次级代谢物洛伐他汀生物合成的影响。蔗糖和葡萄糖等快速利用碳源产洛伐他汀量较低,且易积累其直接前体monacolin J;淀粉和甘油等缓慢利用碳源有利于细胞生长和产物合成,其monacolin J积累相对较少,甘油为碳源时,可获得最高产物量(937.5±12.3)mg/L,乳糖不利于细胞生长导致较低的产物量。以淀粉为碳源时,其初始水平的增加可促进洛伐他汀的合成,碳质量分数为2%时对底物利用率较高,4%时最高产物量可达(875.4±23.1)mg/L,monacolin J则在2%—3%时积累较多,同时产生较多的2-甲基丁酸。

生物法合成辛伐他汀

通过提高E.coli BL21(DE3)/pAW31菌株中的酰基转移酶LovD的表达,并以Monacolin J为底物,催化合成辛伐他汀。考察发酵培养基和发酵条件对酰基转移酶LovD表达的影响;采用SDS-PAGE凝胶电泳法检测酰基转移酶LovD表达情况;并建立酶活测定方法,测定酰基转移酶LovD的实际酶活。通过实验确定酰基转移酶LovD摇瓶发酵的最佳条件:发酵培养基为TB培养基,接种量为4%,诱导初始菌密度为0.7(OD600)I,PTG浓度为0.2 mmol/L,在20℃下诱导20 h。在最佳条件下,酰基转移酶LovD的表达水平为100 mg/L,辛伐他汀的产量为1.2 g/L。

生物合成过程中莫那克林J的高效液相色谱法测定方法

目的建立辛伐他汀生物合成过程中的莫那克林J的HPLC测定方法。方法色谱柱填料为C18多孔微粒键合硅胶,流动相为0.1%磷酸-乙腈(30∶70),流速为1 mL.min-1,检测波长238 nm;用HPLC控制洛伐他汀发酵液经碱裂解制备的莫那克林J及土曲霉基因改良工程菌直接发酵得到的莫那克林J含量。结果开环莫那克林J在10～500μg.mL-1内线性良好,r为0.999 8;经HPLC检测,洛伐他汀发酵液经碱裂解后提取得到莫那克林J开环酸的含量为92%,收率为96.24%,而土曲霉基因改良工程菌发酵液中则残留较多的洛伐他汀,与莫那克林J比例约为1.1∶1.0。结论本实验建立的方法可以将莫那克林J、辛伐他汀及洛伐他汀的开环形式与闭环形式完全分开,适合用于辛伐他汀生物合成过程莫那克林J的研究。