小鼠单克隆抗体IgM Fabμ片段的制备

本文介绍了小鼠单克隆抗体IgM小分子活性片段的制备方法。在37℃和4℃下用胰蛋白酶消化IgM 4和24小时,其小片段用碘代乙酰胺烷基化,用Sephacryl S-200柱层析纯化。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实:在37℃用胰酶裂解IgM,小片段分子量近50000(Fab),但其免疫活性较低:在4℃胰酶裂解IgM,小片段分子量为80 000～110 000(Fabμ),免疫活性与原IgM基本一致。我们用Fab μ片段与辣根过氧化物酶连接,其结合物用于双抗体夹心酶联免疫吸附试验,取得了满意的结果。

人源VEGF单克隆抗体Fabμ和Fc5μ片段的制备

用胰蛋白酶将Mr为900 k的人源VEGFIgM单抗切成Fabμ和五聚的Fc片段(Fc5μ)。用Sephacryl S-200对分离纯化两片段,用间接ELISA法测定IgM抗体及Fabμ片段的抗原结合活性。结果表明:按酶∶IgM为1∶30加入胰蛋白酶,63℃酶切30 min,可使IgM水解完全。用Sephacryl S-200纯化后,片段纯度≥90%。经ELISA间接法测定Fabμ的抗原结合活性后发现,虽与完整的五聚体IgM相比亲和力有所下降,但仍有较好的抗原结合活性,相对亲和力为4.29×108。

抗人IgG Fc片段及Fab段单抗的鉴定及应用

本实验采用木瓜酶水解,SPA柱亲合层析等手段得到人IgGFc段及Fab段,以Sigma抗人IgGfFc段和抗人IgG Fab段单抗为标准品,鉴定了细胞库中抗人IgG系列的部分细胞株,得到特异性分泌抗人IgG Fc段和抗人IgG Fab段单抗的细胞各一株。 在上述实验基础上,用抗人IgG Fc及抗人IgG Fab单抗分别制备了Sepharose4B亲合层析柱,提纯了酶解人IgG Fc、Fab片段,经ELISA法鉴定,相互之间无交叉反应。同时用此方法制备了人抗HBe Fab片段,并将该片段进行了过氧化物酶标记,用来配制HBe ELISA诊断盒,证明其生物活性未受影响,而且消除了类风湿因子引起的HBe Ag假阳性现象。因抗HBe单抗来源困难,如采用HBe多抗制备ELISA试剂,本法将是提高质量的一个好方法。

木瓜蛋白酶的原位固定化及理化性质研究

以氨基载体原位固定化PEG相中的木瓜蛋白酶,获得了高固定化率（95.9%）和酶活回收率（38.9%）的固定化木瓜蛋白酶,解决了双水相分离纯化后成相聚合物和目的蛋白难以分离的问题。固定化木瓜蛋白酶的最适p H在7.0左右,最适温度处于60-70℃之间。相比游离木瓜蛋白酶,在广泛的p H区间内（3.0-9.0）固定化酶稳定性都较好,热稳定性也有改善。在4℃密闭容器内将固定化木瓜蛋白酶以湿润状态保存可以较好地保留其活性。LH-HA固定化木瓜蛋白酶可以特异性地水解单克隆抗体Ig G,制备Fab和Fc片段。