实时PCR分析△^5脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用

花生四烯酸是人体的必需脂肪酸，具有独特的生物活性。△^5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径中催化二高-γ-亚麻酸脱饱和为花生四烯酸的酶。通过实时定量PCR技术，检测了△^5脱饱和酶在不同花生四烯酸产量的高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株M10、M6和M23中的mRNA表达水平，以及在高产花生四烯酸菌株M6培养过程中的mRNA表达水平的动态变化。发现岔脱饱和酶基因的mRNA表达水平与花生四烯酸的产生之间存在明显的线性关系，表明△^5脱饱和酶在高山被孢霉花生四烯酸合成途径中起到了非常重要的作用。

高山被孢霉ω-3脂肪酸脱饱和酶基因在麦胚无细胞蛋白质合成系统中的表达

无细胞蛋白质合成系统具有快速、方便等特点,能表达对活细胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽,近年来被广泛应用。以来自产油丝状真菌高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成途径中的关键膜结合酶——ω-3脂肪酸脱饱和酶为研究对象,构建了适宜体外表达ω-3脂肪酸脱饱和酶的表达载体p IVEX WG1.4-FADS15,并利用麦胚无细胞蛋白质合成系统实现了对该基因的高效表达。同时,通过在麦胚无细胞蛋白质合成过程中添加脂质体的方法,将所表达的膜蛋白正确定位至脂质体磷脂双分子层,以便目标蛋白质的正确折叠。研究结果显示,在此实验条件下目标蛋白质的表达量达1.8 mg/m L,经碘海醇密度梯度超速离心纯化后,该蛋白质的纯度可以达到90%以上。研究结果为后续对该酶进行催化特性研究和蛋白质晶体结构解析奠定了基础。