林麝白介素-2在毕赤酵母中的表达

克隆林麝(Moschus.berezovskii)白介素-2(interleukin-2,IL-2)到酵母表达载体pPIC9K,SalⅠ酶切后转化毕赤酵母GS115,G418抗性筛选高拷贝克隆,再由酵母菌落PCR鉴定;阳性克隆用甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析,结果在诱导至第6d的酵母上清浓缩液中,检测到与预测林麝IL-2分子量相接近的,分子量约为18Ku的诱导表达带;TRIzol提取表达期间的酵母总RNA,并通过RT-PCR扩增IL-2mRNA,发现表达期的重组酵母细胞中存在IL-2mRNA,而对照没有检出,表明林麝IL-2存在低水平的表达。

林麝IL-2细胞因子的克隆、表达和纯化

用林麝(Moschus berezovskii)外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)提取总RNA,RT-PCR扩增IL-2(interleukin-2,IL-2),连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并测序。然后将IL-2成熟肽编码序列连接到pGEX4T-1原核表达载体进行表达、纯化。结果表明林麝IL-2开放阅读框全长468 bp,编码155个氨基酸。序列分析表明,林麝IL-2及其受体结合域与水牛的高度保守,而在翻译后修饰的预测活性位点上和水牛的有所不同。IPTG诱导林麝IL-2蛋白表达,得到约41 kD的目标带;优化表达后,林麝IL-2表达含量达到了总蛋白量的25%。经GST亲和柱分离纯化,得到了约41 kD的单一目标带,这说明林麝IL-2基因的原核表达成功。